BMSCs與ALN-CS-nHA支架材料復合構建組織工程骨的體外實驗研究.pdf

1、【目的】
　　1、體外進行rBMSCs（ratbone marrow stromal cells,大鼠骨髓間充質干細胞）的分離、培養(yǎng)、鑒定；
　　2、rBMSCs與ALN/CS/nHA（新型阿倫磷酸鈉-殼聚糖-納米羥基磷灰石支架材料）共培養(yǎng)并成骨誘導，研究用ALN/CS/nHA與種子細胞BMSCs復合構建組織工程骨的可行性。
　　【方法】
　　1、體外進行分離、培養(yǎng)、鑒定rBMSCs：貼壁培養(yǎng)法分離和培養(yǎng)rBMS

2、Cs，通過FCM（Flow cytometry，流式細胞儀）鑒定rBMSCs表面抗原分子（CD73、CD90、CD105、CD34、CD45）的表達率檢測所得rBMSCs的純度；
　　2、rBMSCs復合ALN/CS/nHA體外構建組織工程骨的實驗研究：a、獲取p3代rBMSCs，與ALN/CS/nHA進行體外復合培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，MTT法進行測定rBMSCs的增殖能力、SEM（Scanning electron

3、 microscope，掃描電鏡）下觀察細胞在材料表面的黏附情況，總體評估細胞與支架材料之間的相容性。b、rBMSCs與ALN/CS/nHA體外成骨誘導，于第3、7、10天檢測細胞內ALP含量，第3、6、9、12、15天檢測上清液中Ⅰ型膠原蛋白的含量。對比分析新型材料有無促進rBMSCs成骨作用。
　　【結果】
　　1、貼壁培養(yǎng)法成功分離、培養(yǎng)rBMSCs，經(jīng)流式細胞儀檢測，CD90，CD105，CD73陽性率達到95％，C

4、D34、CD45的陽性表達率在5%以下；
　　2、細胞生長特性：rBMSCs與ALN/CS/nHA復合培養(yǎng)，隨著培養(yǎng)時間的延長，三組細胞的數(shù)量逐步提高，最初3d實驗組、對照組和空白組細胞均處于生長潛伏期，第3天后各組細胞數(shù)量明顯增加，第6天后各組細胞進入生長平臺期，重復測量方差分析，顯示組間無差別(P>0.05)。SEM結果顯示細胞在ALN/CS/nHA表面黏附良好；3、經(jīng)成骨誘導后第7、14天的細胞材料復合物均有ALP(Alka

5、line phosphatas，堿性磷酸酶)、Ⅰ型膠原蛋白表達，實驗組細胞ALP及Ⅰ型膠原蛋白表達量總體高于對照組及空白組。重復測量方差分析，顯示組間有差別(P<0.05)。
　　【小結】
　　1、大鼠骨髓中可以分離、培養(yǎng)出體外培養(yǎng)條件下生長良好的且具有分化潛能的 rBMSCs，第3代細胞在成骨誘導培養(yǎng)下可以向成骨細胞分化；
　　2、rBMSCs可與ALN/CS/nHA良好粘附并增殖，且保持正常細胞形態(tài)。ALN/CS/