轉(zhuǎn)基因CHO復(fù)合仿生支架體外構(gòu)建組織工程皮膚研究.pdf

1、目的：目前全球1.5億人患有2型糖尿病，每年大約有3％～6％糖尿病患者發(fā)生足部潰瘍，所以治療糖尿病潰瘍成為一個(gè)亟需解決的臨床問題。本研究選擇血小板衍化生長因子(platelet-derivedgrowthfactors)家族中活性最強(qiáng)的PDGF-BB作為目的蛋白，構(gòu)建攜帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的PDGF-B真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞獲得穩(wěn)定表達(dá)PDGF-BB蛋白的細(xì)胞系，應(yīng)用天然生物高分子水凝膠材料制備成三維細(xì)胞支架以負(fù)載轉(zhuǎn)基因種子細(xì)胞構(gòu)

2、成組織工程皮膚，實(shí)現(xiàn)給藥時(shí)PDGF-BB與創(chuàng)面的連續(xù)接觸及保持創(chuàng)面的濕修復(fù)環(huán)境，為后期糖尿病大鼠皮膚潰瘍動(dòng)物試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 方法：從人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalveinendothelialcell，HUVEC)中分離總RNA；根據(jù)GenBank中報(bào)告的rhPDGF-BBcDNA序列，在上下游計(jì)物中加入BamHI和NheI的酶切位點(diǎn)序列；進(jìn)行RT-PCR獲得rhPDGF-BBcDNA；構(gòu)建克隆質(zhì)粒pMD19-T

3、/rhPDGF-BB，經(jīng)測序正確后，再將該目的片段與真核表達(dá)載體pSELECT-GFPzeo-MCS連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)菌落篩選得到含GFP報(bào)告基因的非融合型表達(dá)載體pSELECT-GFPzeo/rhPDGF-BB質(zhì)粒；然后將其轉(zhuǎn)染入中國倉鼠卵巢細(xì)胞(chinesehamsterovarycell，CHO)，經(jīng)Zeocin抗生素篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，應(yīng)用細(xì)胞熒光及免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定，酶聯(lián)免疫吸附法(enzymeli

4、nkedimmunosorbentassay，EIISA)檢測目的蛋白的表達(dá)量，采用噻唑藍(lán)(thiazolylblue，MTT)法檢測其對(duì)NIH3T3細(xì)胞生長的作用。 選擇天然生物高分子材料殼聚糖經(jīng)N-乙酰-L-半胱氨酸(n-acetyl-1-cysteinen，NAC)修飾后合成含321.4μmol/g巰基的雙硫鍵殼聚糖，稱取10mg的樣品溶于1ml去離子水中生成水凝膠，對(duì)水凝膠的溶脹度及細(xì)胞毒性進(jìn)行檢測；將該水凝膠負(fù)載轉(zhuǎn)基因

5、CHO細(xì)胞構(gòu)成組織工程皮膚，并進(jìn)行表征。 結(jié)果：RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳顯示為一長約681bp的清晰條帶，將純化后的產(chǎn)物與pMD19-T克隆載體連接，陽性克隆質(zhì)粒經(jīng)BamHI和NheI的雙酶切可得到約681bp的條帶，測序證實(shí)與GenBank中的序列完全相符；將PDGF-B基因與表達(dá)載體pSELECT-GFPzeo-MCS連接，經(jīng)雙酶切后得到約681bp的條帶，測序證實(shí)與GenBank中的序列完全相符，轉(zhuǎn)化E.col

6、iDH5α感受態(tài)菌篩選得到表達(dá)載體pSELECT-GFPzeo/rhPDGF-BB質(zhì)粒；然后將其轉(zhuǎn)染入CHO細(xì)胞，經(jīng)Zeocin抗生素篩選8周后獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，綠色熒光持續(xù)表達(dá)，免疫細(xì)胞化學(xué)染色法顯示胞漿中存在大量陽性顆粒，ELISA法檢測目的蛋白的表達(dá)量為5.85μg/24h/106cells，MTT法檢測其對(duì)NIH3T3細(xì)胞生長具有明顯的促增殖的作用，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。 選擇分子量為300KDa、

7、脫乙酰度86％的殼聚糖經(jīng)NAC改性后合成含321.4μmol/g巰基的雙硫鍵殼聚糖，其穩(wěn)定性良好；水凝膠的溶脹度良好，MTT法檢測該水凝膠對(duì)細(xì)胞沒有毒性，不影響細(xì)胞增殖，組間存在差異(p<0.05)；將該水凝膠負(fù)載轉(zhuǎn)基因CHO細(xì)胞構(gòu)成組織工程皮膚，掃描電鏡顯示其成互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，孔徑比較均一，細(xì)胞粘附良好。 結(jié)論：成功構(gòu)建含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的PDGF-BB真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞獲得穩(wěn)定表達(dá)PDGF-BB蛋白的細(xì)胞系，其分泌