基于自體血漿蛋白支架的組織工程皮膚樣復(fù)合物的構(gòu)建、應(yīng)用與評(píng)價(jià).pdf

1、皮膚缺損的修復(fù)，尤其是慢性創(chuàng)面，難愈性潰瘍創(chuàng)面，全層大面積缺損的治療，一直是整形外科和燒傷外科經(jīng)常遇到的難題，臨床上多采用各種自體皮片、異體皮膚或皮瓣移植修復(fù)，其不僅造成供區(qū)新的創(chuàng)傷，有時(shí)還存在著供皮來(lái)源限制，供區(qū)繼發(fā)性損傷大，異體皮膚移植引起免疫排斥反應(yīng)等眾多問(wèn)題。隨著組織工程技術(shù)研究的深入，應(yīng)用組織工程皮膚修復(fù)皮膚缺損是目前皮膚缺損修復(fù)研究的熱點(diǎn)之一，各國(guó)專家學(xué)者都研究了許多種構(gòu)建組織工程皮膚的方法，為臨床解決皮膚缺損的修復(fù)提供了新

2、的思路。盡管目前已有的組織工程化皮膚，已具有與正常皮膚類似的結(jié)構(gòu)及屏障功能，應(yīng)用于臨床取得了一定療效，但是很多組織工程皮膚產(chǎn)品仍不成熟，距理想的組織工程皮膚尚有不少差距，存在自體種子細(xì)胞來(lái)源缺乏、異體種子細(xì)胞誘發(fā)免疫排斥反應(yīng)、體外培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、缺乏血管、治療費(fèi)用貴等缺點(diǎn)。因此，有必要去探索構(gòu)建一種新型的具有良好應(yīng)用前景的組織工程皮膚。 目的：研制一種新型的組織工程支架——自體血漿纖維蛋白，將取自自體皮膚培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞及表皮細(xì)胞分

3、別接種自體血漿制成的支架上，構(gòu)建一種組織工程皮膚樣復(fù)合物。并將該組織工程支架移植于動(dòng)物筋膜層，觀察支架與組織的融合及毛細(xì)血管的生長(zhǎng)情況，探討該組織工程皮膚樣復(fù)合物修復(fù)全層皮膚缺損的可行性。 方法：1．采集大鼠自體的血漿與纖維蛋白原融合后制成固態(tài)的血漿纖維蛋白支架，行形態(tài)學(xué)觀察及物理學(xué)及生物學(xué)評(píng)價(jià)。2．取大鼠自體皮膚，通過(guò)酶消化法分離表皮與真皮層，原代培養(yǎng)表皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞，用免疫熒光技術(shù)進(jìn)行CK及波形絲蛋白的鑒定及形態(tài)學(xué)觀察。

4、3．將第3-5代的成纖維細(xì)胞及表皮細(xì)胞接種于血漿纖維蛋白支架上，構(gòu)建組織工程皮膚樣復(fù)合物，行HE及電鏡觀察。ELISA法測(cè)定成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中TGF—B1、bFGF含量。4．將血漿蛋白支架移植到大鼠皮下筋膜層，觀察蛋白支架內(nèi)毛細(xì)血管生長(zhǎng)情況，分別取第3，5，7，14，21，28天的全層皮膚行組織學(xué)、免疫組織化學(xué)觀察。 結(jié)果：1．制備的血漿纖維蛋白膠呈清亮暗紅色，表面有光澤，可輕松從圓玻片上剝下來(lái)，用鑷子鑷起，形狀規(guī)則，圓形，直徑

5、約1.3cm。HE呈嗜伊紅染色，染色均勻，電鏡可以觀察到顯著的網(wǎng)狀多孔結(jié)構(gòu)。支架的降解速度適宜種子細(xì)胞的生長(zhǎng)完全，且微生物學(xué)檢測(cè)陰性。2．角質(zhì)形成細(xì)胞及成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)良好，均貼壁生長(zhǎng)。CK及波形絲蛋白免疫熒光染色，表現(xiàn)為陽(yáng)性反應(yīng)。3．角質(zhì)形成細(xì)胞及成纖維細(xì)胞在血漿纖維蛋白支架上生長(zhǎng)良好，光鏡下可見(jiàn)細(xì)胞間連接緊密，HE染色顯示細(xì)胞鋪滿支架表面，電鏡顯示細(xì)胞已長(zhǎng)入支架內(nèi)部。4．血漿蛋白支架植入大鼠皮下筋膜層后，創(chuàng)面愈合良好，未見(jiàn)排斥反應(yīng)

6、，HE染色見(jiàn)少許炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，移植5天后可見(jiàn)新生內(nèi)皮細(xì)胞芽，7天后可見(jiàn)毛細(xì)血管管狀結(jié)構(gòu)，加入VEGF的支架血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯快于不加VEGF的支架。 結(jié)論：利用自體血漿制備的纖維蛋白支架無(wú)毒性，來(lái)源方便，制備簡(jiǎn)單，費(fèi)用低廉，可以作為一種新型的組織工程支架。自體的角質(zhì)形成細(xì)胞及成纖維細(xì)胞接種在此支架上生長(zhǎng)良好，能很快鋪滿全層，說(shuō)明為種子細(xì)胞的生長(zhǎng)提供了有利的基質(zhì)。血漿纖維蛋白膠植入大鼠筋膜層，可見(jiàn)膠中有新生血管樣結(jié)構(gòu)長(zhǎng)出證