同種異體脫蛋白骨復合纖維蛋白膠構建骨組織工程支架的實驗研究.pdf

1、目的： (1)將纖維蛋白膠與脫蛋白骨復合，觀察骨髓基質干細胞(BMSC)在復合材料中的生長、分化情況； (2)探討復合纖維蛋白膠的脫蛋白骨與單純脫蛋白骨作為BMSC支架材料在兔肌袋中異位成骨情況的差異； (3)制作兔橈骨缺損模型，探討復合纖維蛋白膠的脫蛋白骨與單純脫蛋白骨作為BMSC支架材料在兔體內修復骨缺損情況的差異，為骨組織工程提供合適的復合支架材料。 方法： (1)脫蛋白骨的制備：取新西蘭大

2、白兔雙側髂骨松質部分加工成不同規(guī)格骨粒，經(jīng)過氧化氫、氯仿一甲醇溶液、乙二胺及無水乙醇等化學物質處理后脫去大部分蛋白成分，凍干后Co<'60>照射消毒。通過骨髓穿刺獲健康成年新西蘭大白兔BMSC，體外常規(guī)原代培養(yǎng)，傳代至第三代后用于實驗接種，細胞數(shù)量約為5×10<'5>。實驗組使用復合纖維蛋白膠的脫蛋白骨與BMSC復合培養(yǎng)，對照組用單純脫蛋白骨與BMSC復合培養(yǎng)，取不同時間點進行光學顯微鏡觀察、掃描電鏡觀察、細胞DNA含量檢測及鈣結節(jié)染色

3、比較兩組細胞的生長、分化情況。 (2)健康成年新西蘭大白兔28只，隨機分為實驗組12只，對照組12只，空白組4只。實驗組為脫蛋白骨+FG+BMSC，對照組為脫蛋白骨+BMSC，空白組為單純脫蛋白骨組。實驗組與對照組動物分別于術后4、8、12周取材作相關檢查，空白組于術后2周、4周取材作相關檢查。手術將各組材料分別植入兔背部肌袋內，取材后進行大體觀察、X線檢測、堿性磷酸酶(ALP)測定、生物力學檢測及組織學檢查比較各組異位成骨情況

4、，并通過局部組織學淋巴細胞定量和全身免疫學CD4、CD8陽性細胞分析判定免疫反應情況。 (3)取新西蘭大白兔20只，隨機選18只做左右雙側橈骨缺損，分別為實驗組和對照組，空白組2只。實驗組為脫蛋白骨+FG+BMSC，對照組為脫蛋白骨+BMSC，空白組為單純脫蛋白骨組。制作兔橈骨1.2cm缺損模型，手術予各組材料分別修復兔橈骨缺損，取術后4、8、12周進行大體觀察、X線檢測、堿性磷酸酶測定生物力學檢測及組織學檢查比較各組修復骨缺損

5、情況。 結果： (1)倒置顯微鏡及掃描電鏡可見實驗組細胞粘附明顯多于對照組，并成三維空間生長，隨培養(yǎng)時間的延長，實驗組附著細胞增殖及分泌均優(yōu)于對照組。細胞總DNA含量測定結果實驗組細胞DNA含量在各個時間點均多于對照組，4、7d時兩組間比較有著性差異(P<0.05)。鈣結節(jié)染色實驗組細胞體外培養(yǎng)7d時可見部分區(qū)域紅染的鈣結節(jié)，對照組未見鈣結節(jié)形成。 (2)植入術后各組動物一般情況正常，傷口Ⅰ期愈合。ALP活性測定

6、經(jīng)析因設計方差分析表明，實驗組較對照組同一時間的ALP活性強(P<0.01)。X線檢測表明術后4、8周時成骨組織塊阻射率實驗組均高于對照組。生物力學檢測組織塊抗壓剛度顯示實驗組明顯優(yōu)于對照組。組織學檢查，實驗組術后4周標本可見大量新生軟骨已向成熟骨組織轉化；對照組標本僅有極少量的成熟骨組織。術后8周，實驗組標本已大部分鈣化為成熟的板層骨；對照組標本邊緣仍見有軟骨組織。使用圖像分析軟件對兩組植入物的成骨量評分，使用SPSS統(tǒng)計學軟件進行析

7、因設計方差分析，結果實驗組體內植入后4、8周時的成骨量高于對照組(P<0.01)，實驗組與對照組植入體內8周時的成骨量均比各自4周時有顯著增高(P<0.01)。隨植入時間的延長，新骨更趨成熟。局部切片淋巴細胞計數(shù)顯示各組均無免疫學反應，全身免疫學指標CD4、CD8陽性細胞分析表明實驗組和對照組術后均無免疫反應發(fā)生。 (3)骨缺損修復術后動物一般情況正常，取材可見4周時實驗組骨痂生長活躍，缺損基本修復，對照組缺損部分修復，8周時兩

8、組均已修復。X線檢測表明術后4、8周時缺損處阻射率實驗組均高于對照組，ALP活性測定經(jīng)析因設計方差分析表明，實驗組較對照組同一時間的ALP活性強(P<0.01)。生物力學檢測三點彎曲實驗顯示實驗組強度明顯優(yōu)于對照組。組織學檢查，實驗組術后4周骨成熟多于對照組。術后8周，實驗組標本已大部分鈣化為成熟的板層骨；對照組標本邊緣仍見有軟骨組織。使用圖像分析軟件對兩組植入物的成骨量評分，使用SPSS統(tǒng)計學軟件進行析因設計方差分析，結果實驗組體內植

9、入后4、8周時的成骨量高于對照組(P<0.01)。隨植入時間的延長，修復更趨完善。 結論： (1)復合纖維蛋白膠的脫蛋白骨比單純脫蛋白骨更有利于細胞的接種粘附，更適合細胞生長、分化，是BMSC的良好載體。 (2)復合纖維蛋白膠的脫蛋白骨其新骨形成速度明顯快于單純組，早期成骨量多于對照組。 (3)復合纖維蛋白膠的脫蛋白骨其修復骨缺損在修復速度和修復質量方面均優(yōu)于單純脫蛋白骨組，表明其可作為BMSC的復合型支