同種異體脫蛋白骨復(fù)合纖維蛋白膠構(gòu)建骨組織工程支架的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： (1)將纖維蛋白膠與脫蛋白骨復(fù)合，觀察骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)在復(fù)合材料中的生長、分化情況； (2)探討復(fù)合纖維蛋白膠的脫蛋白骨與單純脫蛋白骨作為BMSC支架材料在兔肌袋中異位成骨情況的差異； (3)制作兔橈骨缺損模型，探討復(fù)合纖維蛋白膠的脫蛋白骨與單純脫蛋白骨作為BMSC支架材料在兔體內(nèi)修復(fù)骨缺損情況的差異，為骨組織工程提供合適的復(fù)合支架材料。 方法： (1)脫蛋白骨的制備：取新西蘭大

2、白兔雙側(cè)髂骨松質(zhì)部分加工成不同規(guī)格骨粒，經(jīng)過氧化氫、氯仿一甲醇溶液、乙二胺及無水乙醇等化學(xué)物質(zhì)處理后脫去大部分蛋白成分，凍干后Co<'60>照射消毒。通過骨髓穿刺獲健康成年新西蘭大白兔BMSC，體外常規(guī)原代培養(yǎng)，傳代至第三代后用于實(shí)驗(yàn)接種，細(xì)胞數(shù)量約為5×10<'5>。實(shí)驗(yàn)組使用復(fù)合纖維蛋白膠的脫蛋白骨與BMSC復(fù)合培養(yǎng)，對照組用單純脫蛋白骨與BMSC復(fù)合培養(yǎng)，取不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察、掃描電鏡觀察、細(xì)胞DNA含量檢測及鈣結(jié)節(jié)染色

3、比較兩組細(xì)胞的生長、分化情況。 (2)健康成年新西蘭大白兔28只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組12只，對照組12只，空白組4只。實(shí)驗(yàn)組為脫蛋白骨+FG+BMSC，對照組為脫蛋白骨+BMSC，空白組為單純脫蛋白骨組。實(shí)驗(yàn)組與對照組動物分別于術(shù)后4、8、12周取材作相關(guān)檢查，空白組于術(shù)后2周、4周取材作相關(guān)檢查。手術(shù)將各組材料分別植入兔背部肌袋內(nèi)，取材后進(jìn)行大體觀察、X線檢測、堿性磷酸酶(ALP)測定、生物力學(xué)檢測及組織學(xué)檢查比較各組異位成骨情況

4、，并通過局部組織學(xué)淋巴細(xì)胞定量和全身免疫學(xué)CD4、CD8陽性細(xì)胞分析判定免疫反應(yīng)情況。 (3)取新西蘭大白兔20只，隨機(jī)選18只做左右雙側(cè)橈骨缺損，分別為實(shí)驗(yàn)組和對照組，空白組2只。實(shí)驗(yàn)組為脫蛋白骨+FG+BMSC，對照組為脫蛋白骨+BMSC，空白組為單純脫蛋白骨組。制作兔橈骨1.2cm缺損模型，手術(shù)予各組材料分別修復(fù)兔橈骨缺損，取術(shù)后4、8、12周進(jìn)行大體觀察、X線檢測、堿性磷酸酶測定生物力學(xué)檢測及組織學(xué)檢查比較各組修復(fù)骨缺損

5、情況。 結(jié)果： (1)倒置顯微鏡及掃描電鏡可見實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞粘附明顯多于對照組，并成三維空間生長，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，實(shí)驗(yàn)組附著細(xì)胞增殖及分泌均優(yōu)于對照組。細(xì)胞總DNA含量測定結(jié)果實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞DNA含量在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均多于對照組，4、7d時(shí)兩組間比較有著性差異(P<0.05)。鈣結(jié)節(jié)染色實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞體外培養(yǎng)7d時(shí)可見部分區(qū)域紅染的鈣結(jié)節(jié)，對照組未見鈣結(jié)節(jié)形成。 (2)植入術(shù)后各組動物一般情況正常，傷口Ⅰ期愈合。ALP活性測定

6、經(jīng)析因設(shè)計(jì)方差分析表明，實(shí)驗(yàn)組較對照組同一時(shí)間的ALP活性強(qiáng)(P<0.01)。X線檢測表明術(shù)后4、8周時(shí)成骨組織塊阻射率實(shí)驗(yàn)組均高于對照組。生物力學(xué)檢測組織塊抗壓剛度顯示實(shí)驗(yàn)組明顯優(yōu)于對照組。組織學(xué)檢查，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后4周標(biāo)本可見大量新生軟骨已向成熟骨組織轉(zhuǎn)化；對照組標(biāo)本僅有極少量的成熟骨組織。術(shù)后8周，實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本已大部分鈣化為成熟的板層骨；對照組標(biāo)本邊緣仍見有軟骨組織。使用圖像分析軟件對兩組植入物的成骨量評分，使用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行析

7、因設(shè)計(jì)方差分析，結(jié)果實(shí)驗(yàn)組體內(nèi)植入后4、8周時(shí)的成骨量高于對照組(P<0.01)，實(shí)驗(yàn)組與對照組植入體內(nèi)8周時(shí)的成骨量均比各自4周時(shí)有顯著增高(P<0.01)。隨植入時(shí)間的延長，新骨更趨成熟。局部切片淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示各組均無免疫學(xué)反應(yīng)，全身免疫學(xué)指標(biāo)CD4、CD8陽性細(xì)胞分析表明實(shí)驗(yàn)組和對照組術(shù)后均無免疫反應(yīng)發(fā)生。 (3)骨缺損修復(fù)術(shù)后動物一般情況正常，取材可見4周時(shí)實(shí)驗(yàn)組骨痂生長活躍，缺損基本修復(fù)，對照組缺損部分修復(fù)，8周時(shí)兩

8、組均已修復(fù)。X線檢測表明術(shù)后4、8周時(shí)缺損處阻射率實(shí)驗(yàn)組均高于對照組，ALP活性測定經(jīng)析因設(shè)計(jì)方差分析表明，實(shí)驗(yàn)組較對照組同一時(shí)間的ALP活性強(qiáng)(P<0.01)。生物力學(xué)檢測三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)顯示實(shí)驗(yàn)組強(qiáng)度明顯優(yōu)于對照組。組織學(xué)檢查，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后4周骨成熟多于對照組。術(shù)后8周，實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本已大部分鈣化為成熟的板層骨；對照組標(biāo)本邊緣仍見有軟骨組織。使用圖像分析軟件對兩組植入物的成骨量評分，使用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行析因設(shè)計(jì)方差分析，結(jié)果實(shí)驗(yàn)組體內(nèi)植

9、入后4、8周時(shí)的成骨量高于對照組(P<0.01)。隨植入時(shí)間的延長，修復(fù)更趨完善。 結(jié)論： (1)復(fù)合纖維蛋白膠的脫蛋白骨比單純脫蛋白骨更有利于細(xì)胞的接種粘附，更適合細(xì)胞生長、分化，是BMSC的良好載體。 (2)復(fù)合纖維蛋白膠的脫蛋白骨其新骨形成速度明顯快于單純組，早期成骨量多于對照組。 (3)復(fù)合纖維蛋白膠的脫蛋白骨其修復(fù)骨缺損在修復(fù)速度和修復(fù)質(zhì)量方面均優(yōu)于單純脫蛋白骨組，表明其可作為BMSC的復(fù)合型支