磷酸鈣骨水泥-纖維蛋白膠與基因修飾骨髓間充質(zhì)干細胞構(gòu)建組織工程骨的相關(guān)研究.pdf

1、背景:腫瘤及創(chuàng)傷等疾患引起的大塊骨缺損一直是骨科醫(yī)生面臨的難題之一，長期以來國內(nèi)外學(xué)者進行了大量相關(guān)研究與臨床實踐。近年來，隨著細胞生物學(xué)和生物材料科學(xué)的發(fā)展，組織工程學(xué)作為高新技術(shù)領(lǐng)域中一門多學(xué)科交叉的新興邊緣學(xué)科應(yīng)運而生，并得到了迅速的發(fā)展。利用組織工程學(xué)方法和手段修復(fù)骨缺損是一種全新的治療模式，具有廣闊的應(yīng)用前景。但由于難以獲得具有良好生物學(xué)活性的種子細胞，目前尚無一種方法能高質(zhì)量地修復(fù)大塊骨缺損并達到很好的遠期療效。BMP-2是

2、BMPs家族的一員，在體外和體內(nèi)實驗中證明有誘導(dǎo)成骨、促進骨修復(fù)的作用。但外源性生長因子半衰期短，局部使用很快被稀釋和代謝，故需反復(fù)大劑量使用，而且價格亦非常昂貴。通過何種方法使生長因子持續(xù)高效發(fā)揮作用一直是骨組織工程學(xué)研究的關(guān)鍵問題。 隨著基因工程的發(fā)展，組織工程學(xué)與分子生物學(xué)有機結(jié)合，運用分子生物學(xué)的理論和技術(shù)，組織誘導(dǎo)因子、種子細胞及生物材料的相互作用，為研制能更有效地恢復(fù)、維持或改善病損組織功能的生物替代物即基因修飾組織

3、工程奠定基礎(chǔ)。特別是以病毒載體為基礎(chǔ)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的應(yīng)用，為組織工程學(xué)中細胞因子的獲得提供了一條的新思路。腺病毒載體被認為是基因治療中很有前途的重要工具，具有很多優(yōu)點，如能有效轉(zhuǎn)染增殖和非增殖細胞，蛋白表達水平高，沒有插入性突變的危險，無包膜不易被補體滅活等。組織工程和基因工程的有機結(jié)合，為解決骨缺損修復(fù)問題帶來了希望。本實驗擬在以往的研究基礎(chǔ)上，將具有多重生物學(xué)效應(yīng)的hBMP-2基因通過腺病毒載體轉(zhuǎn)入骨髓間充質(zhì)干細胞(bonemarr

4、owmesenchymalstemcells，BMSCs)，與用可吸收磷酸鈣骨水泥(calciumphosphatecement，CPC)/纖維蛋白膠(fibringlue，F(xiàn)G)體外構(gòu)建的復(fù)合支架材料復(fù)合，為用基因修飾組織工程學(xué)技術(shù)高質(zhì)量地修復(fù)骨缺損奠定實驗基礎(chǔ)。 目的:以復(fù)制缺陷的腺病毒Adeno-XTM為基因轉(zhuǎn)移載體，制備攜帶hBMP-2促骨生長細胞因子基因的高滴度腺病毒液，感染兔骨髓間充質(zhì)干細胞，利用外源性基因編碼的生長

5、因子誘導(dǎo)其表達成骨細胞表型；用可吸收磷酸鈣骨水泥/纖維蛋白膠體外構(gòu)建符合骨組織結(jié)構(gòu)的復(fù)合支架材料，取長補短，充分發(fā)揮CPC良好的力學(xué)性能以及與骨完全一致的無機晶格的優(yōu)勢，利用FG的粘性以增強CPC的力學(xué)性能，同時利用其對種子細胞的吸附及包裹作用，吸附基因修飾BMSCs構(gòu)建成一種新型的基因修飾組織工程骨；并通過體外和體內(nèi)實驗評估所構(gòu)建的組織工程骨，觀察該方法的可行性和有效性，以期找到一種較理想的骨缺損修復(fù)材料。 方法:(1)采用全

6、骨髓法自兔骨髓中分離培養(yǎng)兔BMSCs，觀察原代及傳代BMSCs形態(tài)特點、生長特性，摸索其誘導(dǎo)分化為成骨細胞的條件，探討其作為骨組織工程種子細胞的可行性。(2)用攜帶外源性目基因BMP-2的腺病毒Adeno-XTM/BMP-2感染兔BMSCs，觀察感染前后BMSCs形態(tài)及生長的變化，利用免疫組織化學(xué)染色及原位雜交從蛋白和mRNA水平鑒定感染后BMSCs重組腺病毒目的基因表達情況，并通過成骨細胞表型檢測及堿性磷酸酶染色、鈣結(jié)節(jié)Von-Kos

7、sa染色等方法觀察其成骨分化的能力。(3)用可吸收CPC/FG體外構(gòu)建符合骨組織結(jié)構(gòu)的支架材料，通過X線衍射(X-raydiffraction，XRD)、掃描電鏡(scanningelectronicmicroscope，SEM)、抗壓實驗和空隙率測試等方法對其凝結(jié)時間、力學(xué)性能及結(jié)構(gòu)等理化特性進行分析，評價其作為組織工程骨支架材料的可行性。(4)將用可吸收CPC/FG復(fù)合支架材料與腺病毒感染后的兔BMSCs共同培養(yǎng)，在體外構(gòu)建組織工程

8、化骨。并通過組織染色、SEM等方法體外和體內(nèi)觀察了解細胞在支架材料上粘附、生長和合成分泌骨基質(zhì)成分的情況。(5)制備兔橈骨缺損模型，以綠色熒光蛋白(greenfluorescenceprotein，GFP)標(biāo)記的組織工程化骨移植修復(fù)缺損區(qū)，以示蹤種子細胞的轉(zhuǎn)歸。同時設(shè)計缺損模型自行修復(fù)組(D組，實驗對照)、單純可吸收CPC/FG復(fù)合支架材料修復(fù)組(C組)，感染和未經(jīng)腺病毒感染BMSCs復(fù)合可吸收CPC/FG復(fù)合支架材料修復(fù)(A和B組)組

9、進行對比研究。術(shù)后4w、8w、12w取材，通過大體形態(tài)，X線攝片，單光子發(fā)射計算機斷層攝影(singlephotonemissioncomputedtomography，SPECT)，組織學(xué)染色等方法觀察骨缺損修復(fù)情況，了解修復(fù)組織中細胞的分化和材料的降解情況，綜合評估所制備的組織工程骨的有效性。 結(jié)果:(1)經(jīng)全骨髓法自兔骨髓中分離培養(yǎng)的兔BMSCs，其原代及傳代BMSCs形態(tài)特點、生長分化特性符合干細胞的特點，自我增殖能力強

10、；在成骨誘導(dǎo)體系(osteogenicsupplements，OS)或rhBMP-2的誘導(dǎo)下能分化為成骨細胞；并且體外擴增容易，適宜作為骨組織工程的種子細胞。(2)Adeno-XTM/BMP-2感染后兔BMSCs形態(tài)特征無顯著變化，但細胞增殖加快，差異均有顯著性意義(p＜0.05)；轉(zhuǎn)染BMP-2后的BMSCs目的基因能高效表達，轉(zhuǎn)染4w后仍能表達；轉(zhuǎn)染BMP-2后的BMSCs無需誘導(dǎo)培養(yǎng)能表現(xiàn)出成骨細胞的結(jié)構(gòu)特征和生物學(xué)特性，骨鈣素含

11、量均較未轉(zhuǎn)染組有顯著增高，差異均有顯著性意義(p＜0.01)，免疫組化檢測Ⅰ型膠原蛋白表達陽性，堿性磷酸酶染色和鈣結(jié)節(jié)Von-Kossa染色陽性。(3)體外構(gòu)建的CPC/FG復(fù)合支架材料所含的結(jié)晶相仍是羥基磷灰石(hydroxyapatite，HAP)，具有表面空隙密度大，三維空隙率小的特點，其抗壓強度達到14MPa，彈性模量在96.64～269.39MPa之間?？障堵始s38.8％，孔徑10～100μm，不均勻分布，初凝時間為5.4±0

12、.3min，終凝時間為7.5±0.3min；而相同條件下制備的純CPC樣品所含的結(jié)晶相是HAP，抗壓強度達到9MPa左右，彈性模量在89.14～89.80MPa之間，空隙率約41.7％，孔徑10～20μm，均勻分布，初凝時間為3.5±0.2min，終凝時間為7.2±0.2min。(4)轉(zhuǎn)染BMP-2后的BMSCs能在CPC/FG復(fù)合材料及單純CPC上粘附、增殖，并能分泌膠原和骨鈣素；在相同符合條件下，CPC/FG復(fù)合材料的細胞粘附數(shù)量、

13、增殖速度及分泌的骨鈣素和堿性磷酸酶活性均大于單純CPC；肌袋實驗顯示：轉(zhuǎn)染BMP-2后的BMSCs與CPC/FG復(fù)合材料構(gòu)建的組織工程骨能異位成骨，而單純CPC/FG復(fù)合材料不能異位成骨。(5)兔橈骨缺損模型修復(fù)實驗顯示：GFP標(biāo)記的BMSC能在回植4w后表達GFP；BMP-2基因轉(zhuǎn)染的BMSC與CPC/FG復(fù)合材料、未轉(zhuǎn)染BMSC與CPC/FG復(fù)合材料和單純CPC/FG復(fù)合材料均能修復(fù)兔橈骨缺損，而對照組均未見骨缺損得到修復(fù)。但轉(zhuǎn)染的

14、BMSCs修復(fù)骨缺損的成骨速度及成骨量均優(yōu)于未轉(zhuǎn)染組，而未轉(zhuǎn)Adeno-XTM/BMP-2組與單純磷酸鈣骨水泥/纖維蛋白膠材料組相比，無明顯差異。 結(jié)論:(1)用全骨髓法分離培養(yǎng)的兔BMSCs，取材容易，體外擴增快，在成骨誘導(dǎo)下能分化為成骨細胞，適宜作為骨組織工程的種子細胞。(2)Adeno-XTM是一種方便高效的腺病毒表達系統(tǒng)，利用其可以使得目的基因得到有效表達，BMP-2是一種良好的骨誘導(dǎo)生長因子，而BMSC是基因轉(zhuǎn)染的理想