新型磷酸鈣復(fù)合骨水泥對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物相容性及成骨分化的研究.pdf

1、目的：研究新型磷酸鈣復(fù)合骨水泥（磷酸鈣骨水泥/骨基質(zhì)明膠、磷酸鈣骨水泥/骨基質(zhì)明膠+聚乳酸-羥基乙酸共聚物空白微球）對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone mesenchymal stem cell，BMSCs)的體外骨誘導(dǎo)活性及細(xì)胞毒性。以期獲得一種適合骨缺損修復(fù)的新型人工復(fù)合骨水泥，尤其能夠作為骨質(zhì)疏松壓縮性骨折的骨修復(fù)材料。
　　方法：1.通過(guò)W/O/W微球制備法自制聚乳酸-羥基乙酸共聚物空白微球（PLGA空白微球），稱(chēng)重分裝并紫

2、外線(xiàn)滅菌備用，按特定比例加入復(fù)合骨水泥;采用Urist等方法利用兔四肢長(zhǎng)骨干經(jīng)粉碎、脫脂脫鈣等處理后制得骨基質(zhì)明膠骨粉(BMG)，將骨基質(zhì)明膠骨粉稱(chēng)重分裝并環(huán)氧乙烷滅菌備用。2.依據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在磷酸鈣骨水泥(CPC)與骨基質(zhì)明膠骨粉按5∶1混合的基礎(chǔ)上再按總重量的5％加入PLGA空白微球，再與固化液均勻攪拌，注射進(jìn)預(yù)制的塑料模具制成圓柱狀的新型磷酸鈣復(fù)合骨水泥，同理制得單純的CPC組、及不含微球的復(fù)合骨水泥組，并通過(guò)完全培養(yǎng)基的浸泡

3、后制成三組材料的浸提液。3.選用3周齡左右體重在80-100g的SD大鼠，在分離大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法，通過(guò)三次傳代后得到生長(zhǎng)旺盛、形態(tài)穩(wěn)定的P3代細(xì)胞。4.將實(shí)驗(yàn)組分為CPC組（A組）、CPC∶BMG組（B組）、CPC∶BMG+5％PLGA組（C組）三個(gè)實(shí)驗(yàn)組，掃描電鏡觀察所制備的微球、骨基質(zhì)明膠及CPC和復(fù)合骨水泥的微觀結(jié)構(gòu)，通過(guò)觀察細(xì)胞在材料上的粘附情況及細(xì)胞粘附率的測(cè)定評(píng)估大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在上述材料上的粘

4、附能力;通過(guò)細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)、Cell Counting Kit-8(CCK-8)細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒測(cè)定新型磷酸鈣人工復(fù)合材料對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的毒性作用;通過(guò)堿性磷酸酶測(cè)試盒測(cè)定新型磷酸鈣人工復(fù)合骨水泥在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化過(guò)程的堿性磷酸酶活性的變化情況;使用三組骨水泥的浸提液與大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)并用基茜素紅染色觀察新型磷酸鈣人工復(fù)合骨水泥對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成骨作用。
　　結(jié)果：經(jīng)傳代所獲得的P3代細(xì)胞

5、生長(zhǎng)迅速，形態(tài)均一，多為長(zhǎng)梭形，部分細(xì)胞團(tuán)呈旋渦樣生長(zhǎng)，掃描電鏡觀察微球大小合適，形態(tài)圓，測(cè)量直徑為70-130um之間，CPC及BMG表面具有較多孔隙，但前者孔隙小且數(shù)量相對(duì)較少。干細(xì)胞能在A、B及C三組材料上均能良好粘附生長(zhǎng)，B組、C組上細(xì)胞明顯較多，并可見(jiàn)細(xì)胞向孔隙內(nèi)生長(zhǎng)。CCK-8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明CPC/BMG及CPC/BMG+PLGA空白微球復(fù)合材料基本無(wú)細(xì)胞毒性，通過(guò)在材料中添加骨基質(zhì)明膠可促進(jìn)BMSCs增殖。PKA活性檢測(cè)

6、及茜素紅染色結(jié)果表明CPC/BMG及CPC/BMG+PLGA空白微球復(fù)合材料能夠促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化并產(chǎn)生礦化物質(zhì)，染色呈現(xiàn)不均勻紅色。
　　結(jié)論：PLGA微球與CPC/BMG混合后能夠達(dá)到增大孔徑的目的，利于細(xì)胞、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及血管的流入，為細(xì)胞的爬行起到了支架作用，為新骨的形成提供了有利條件。在磷酸鈣骨水泥中加入骨基質(zhì)明膠后所得的新型復(fù)合材料具有良好的細(xì)胞生物相容性及骨誘導(dǎo)性，PLGA空白微球的加入能夠進(jìn)一步增大該復(fù)合材料