異種骨支架與人骨髓間充質干細胞相容性的實驗研究.pdf

1、目的:(1)研究脫脂、脫蛋白后豬松質骨支架材料的生物學性能。(2)研究脊柱術中出血中的hBMSCs的細胞學特性。(3)探討不同方法改性的豬松質骨支架材料的細胞相容性情況。
　　 方法:(1)通過超聲聯(lián)合化學方法對豬松質骨支架材料進行脫脂、脫蛋白去抗原處理。(2)大體觀察骨支架材料的形貌特征,組織切片HE染色觀察材料的組織學結構,比重法檢測支架材料的孔隙率,檢測支架材料的pH值及微生物生長情況。(3)通過密度梯度離心法分離脊柱手術

2、出血中的hBMSCs;倒置顯微鏡觀察細胞生長情況,流式細胞儀分析第三代hBMSCs表面分子表達情況。對第三代hBMSCs細胞進行成骨誘導培養(yǎng),在誘導后第3、7、14、21天檢測細胞內(nèi)堿性磷酸酶活性;在誘導培養(yǎng)第21天對礦化結節(jié)行茜素紅染色。(4)采用不同材料包被支架材料對支架材料改性,分為A、B、C三組,A組為胎牛血清包被,B組為Ⅰ型膠原蛋白包被,C組為對照組。每塊材料上加入濃度為1×109/ml的細胞懸液250μ l。分別在第6、12

3、、24、48小時采用胰蛋白酶消化細胞計數(shù),計算三組的細胞粘附率;在第3、6、9、12、14天采用MTT法觀察三組的細胞增殖情況。
　　 結果:(1)經(jīng)過處理的骨支架材料外觀呈白色,其表面具有多孔結構微孔壁光滑,HE染色鏡下觀察到網(wǎng)狀骨小梁,骨小梁結構完整,無破壞,骨髓腔中血細胞、脂肪細胞去除,亦未見基質細胞殘留,橢圓形骨陷窩空虛,未見骨細胞核及其它結構。骨支架材料浸泡液pH值第1-7天平均7.356±0.034,呈中性。比重法測

4、得骨支架材料的孔隙率高達81.34％±4.31％。在24、48、72小時三個檢測時間點,浸泡骨支架材料的完全培養(yǎng)基色澤清亮,無混濁及懸浮物,鏡下觀察,亦未發(fā)現(xiàn)細菌及真菌生長。(2)脊柱外科術中出血中分離出原代hBMSCs貼壁生長,呈梭形、多角形。流式細胞儀分析第三代hBMSCs高表達CD73、CD90、CD105,低表達CD14、CD19、CD34、CD45。hBMSCs經(jīng)成骨誘導分化后,隨著時間的延長,堿性磷酸酶活性增高。誘導分化培養(yǎng)

5、21天后茜素紅染色顯示成骨細胞體外礦化特性。(3)采用胰蛋白酶消化法計計算細胞粘附率,hBMSCs粘附率在不同方法處理的支架上細胞粘附時相變化的趨勢不同,比較結果細胞粘附率B組＞A組＞C組。采用MTT法檢測hBMSCs增殖情況,C組細胞增值情況較A、B兩組增值情況比較均具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);而第3、6、9、12、14天A、B兩組之間細胞增殖情況比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　 結論:(1)經(jīng)脊柱術中出血分離的h