兔間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成骨細(xì)胞復(fù)合BG支架的組織相容性研究.pdf

1、研究背景 因創(chuàng)傷、感染、腫瘤、骨壞死及先天畸形等多種疾病引起的骨缺損臨床常見(jiàn)，但治療困難。近二十年來(lái)，組織工程學(xué)的發(fā)展為骨缺損的修復(fù)開(kāi)辟了新的途徑，組織工程技術(shù)的發(fā)展有可能避免傳統(tǒng)治療方法的缺陷，解決修復(fù)與重建這一難題。 組織工程是用生命科學(xué)和工程學(xué)的原理及技術(shù)，構(gòu)建、培育活組織，研制生物替代物，以修復(fù)或重建組織器官的結(jié)構(gòu)，維持或改善組織器官功能的一門(mén)新興的邊緣學(xué)科。組織工程技術(shù)的開(kāi)展需要大量的種子細(xì)胞和良好的細(xì)胞支架材

2、料，才能滿足工程化組織或器官的生成和塑形要求。種子細(xì)胞的培養(yǎng)是組織工程的基本要素，細(xì)胞主要來(lái)源于自體、同種異體、異種組織細(xì)胞等。自體組織細(xì)胞應(yīng)為首選。由于組織工程多需要高濃度的細(xì)胞接種，自體組織細(xì)胞存在著數(shù)量上的局限性及長(zhǎng)期傳代后細(xì)胞功能老化的問(wèn)題，然而，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞取材方便，易于培養(yǎng)，自體移植無(wú)明顯免疫排斥反應(yīng)，被認(rèn)為是組織工程理想的種子細(xì)胞。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠分化成多種中胚層組織，包括骨和軟骨組織、肌腱、肌肉、脂肪組織等。為尋

3、求良好的種子細(xì)胞，我們采用組織工程方法進(jìn)行了上述實(shí)驗(yàn)，將兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外分離、培養(yǎng)誘導(dǎo)后結(jié)果表明：兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外經(jīng)成骨誘導(dǎo)劑或重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白誘導(dǎo)可以誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞。 本課題就是利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多向分化潛能，在體外用化學(xué)誘導(dǎo)劑或骨形態(tài)發(fā)生蛋白對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，并進(jìn)行鑒定，同時(shí)在體外與改良生物活性玻璃支架復(fù)合，構(gòu)建新型組織工程骨，為下一步進(jìn)行體內(nèi)骨缺損修復(fù)與功能重建，提供新途徑。 第一章兔間充質(zhì)干

4、細(xì)胞誘導(dǎo)分化成骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究 研究目的 在體外分離培養(yǎng)8周齡新西蘭兔骨髓MSCs，研究其生長(zhǎng)、擴(kuò)增及誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的特性。 方法 1.兔MSCs的體外分離和培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)，無(wú)菌條件下，從健康8周齡新西蘭兔股骨抽出骨髓，加入含雙抗的DMEM培養(yǎng)基中。經(jīng)密度梯度離心獲得單個(gè)核細(xì)胞，體外培養(yǎng)，分離獲得兔骨髓MSCs，加入DMEM完全培養(yǎng)基(含10％胎牛血清、青霉素鈉100U/ml、鏈霉素100U/

5、ml的高糖DMEM培養(yǎng)液)制成單細(xì)胞懸液。置于5％CO2孵箱內(nèi)37℃培養(yǎng)中。倒置顯微鏡下逐日觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況。 2.兔MSCs的傳代培養(yǎng) 待細(xì)胞長(zhǎng)至瓶底90％面積時(shí)，進(jìn)行消化傳代。吸出培養(yǎng)液，D-Hank液洗滌2次，加入3ml0.25％胰蛋白酶，消化3～5min，加入3ml含血清培養(yǎng)液，離心后去上清液，加入DMEM完全培養(yǎng)基吹打計(jì)數(shù)，以1×104/cm2的密度傳代培養(yǎng)。 3.兔MSCs的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)

6、 將第2代細(xì)胞以5×103/cm2的密度接種至3個(gè)12孔板中，48小時(shí)后全量換液，分為3組進(jìn)行下面實(shí)驗(yàn)： ①空白對(duì)照用RPMI1640的完全培養(yǎng)液，每2～3d換液。②化學(xué)藥物的作用用含地塞米松10-7mol/L、β-甘油磷酸鈉10mmol/L、維生素C50mg/l、10％小牛血清、青霉素鈉100U/ml、鏈霉素100U/ml的RPMI1640的培養(yǎng)液，每2-3d換液；③rhBMP-2的作用用含rhBMP-2(100ng/L)的R

7、PMI1640完全培養(yǎng)液，每2～3d換液； 4.堿性磷酸酶染色 按文獻(xiàn)改進(jìn)方法對(duì)定量標(biāo)本的處理，收集傳代細(xì)胞3組培養(yǎng)分別在誘導(dǎo)分化后2d、5d、12d的細(xì)胞，置于玻璃勻漿器中加入2ml生理鹽水，勻漿，離心(10000rpm×10min)，上清液用作堿性磷酸酶(ALP)檢測(cè)。 5.ALP活性測(cè)定取上清液0.5ml在全自動(dòng)生化分析儀上測(cè)ALP活性水平，ALP活性用U/ml表示。 結(jié)果 1.細(xì)胞培養(yǎng)

8、 原代培養(yǎng)的兔MSCs中，細(xì)胞多為成纖維樣的梭形細(xì)胞，呈團(tuán)簇生長(zhǎng)，向四周發(fā)散。經(jīng)傳代培養(yǎng)后，2～4h開(kāi)始貼壁變形，24h完成貼壁，并向梭形細(xì)胞轉(zhuǎn)化，MSCs經(jīng)誘導(dǎo)后，大圓細(xì)胞貼壁成簇生長(zhǎng)，相對(duì)純化，無(wú)其他雜細(xì)胞，多角形，不規(guī)則細(xì)胞增多，并出現(xiàn)正在分裂的細(xì)胞現(xiàn)象，細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形或橢圓形，細(xì)胞周?chē)置诹舜罅康幕|(zhì)，顯示具有分裂和克隆增殖的能力。 2.ALP染色 MSCs能少量表達(dá)ALP活性，分泌的鈣量較少；誘導(dǎo)分化后

9、的細(xì)胞具有和體內(nèi)成骨細(xì)胞相同的形態(tài)學(xué)特征，ALP染色陽(yáng)性，能表達(dá)Ⅰ型膠原，不表達(dá)Ⅱ型膠原，同時(shí)，原代MSCs和傳代細(xì)胞中的對(duì)照組染色多為陰性，實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞成團(tuán)生長(zhǎng)處強(qiáng)陽(yáng)性，ALP染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞50％。誘導(dǎo)分化后2d，ALP分泌增加；誘導(dǎo)分化后5d、12d細(xì)胞ALP的分泌水平明顯升高，有顯著顯著性意義；采用成骨添加劑和rhBMP-2誘導(dǎo)分化MSCs后相同時(shí)期成骨細(xì)胞ALP活性含量差異明顯。 3.Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原的免疫組織化學(xué)染

10、色 誘導(dǎo)前均為陰性，兩種方法誘導(dǎo)后Ⅰ型膠原陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均為＞65％，Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色陰性。 結(jié)論 密度梯度離心法分離得到的兔骨髓源MSCs，體外培養(yǎng)具有分裂、克隆增殖的能力，在加有成骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑或rhBMP-2的培養(yǎng)基里能誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，生長(zhǎng)因子在定向誘導(dǎo)分化過(guò)程中比化學(xué)藥物作用更顯著。 第二章成骨細(xì)胞與生物活性玻璃支架聯(lián)合培養(yǎng)研究 研究目的 運(yùn)用MSCs定向分化的成骨細(xì)胞評(píng)價(jià)新

11、型生物活性玻璃支架的細(xì)胞相容性，探討體外構(gòu)建成骨細(xì)胞與生物活性玻璃組成的組織工程骨的可行性。 方法 取出支架材料，用RPMI1640含血清培養(yǎng)液浸泡后，無(wú)菌脫脂棉吸干液體后待用。將誘導(dǎo)分化培養(yǎng)7d的細(xì)胞以0.25％胰蛋白酶消化，離心收集后用含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成含5×107/ml的細(xì)胞懸液1ml，3組支架材料各4片放置于12孔培養(yǎng)板，空白對(duì)照組設(shè)4孔各加入相同大小的蓋玻片一片，分別接種上述細(xì)胞懸液1

12、ml，每孔加入RPMI1640完全培養(yǎng)基4ml，于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，48h將復(fù)合體移入培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。每2d用條件培養(yǎng)液(含RPMI1640培養(yǎng)基、地塞米松10-7mol/L、β-甘油磷酸鈉10mmol/L、維生素C50mg/l、10％小牛血清、青霉素鈉100U/ml、鏈霉素100U/ml)換液。倒置顯微鏡逐日觀察成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)情況以及復(fù)合體的降解情況。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別送掃描電鏡觀察，MTT法分析材料對(duì)成骨

13、細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖的影響。 結(jié)果 掃描電鏡下見(jiàn)B、C三組在復(fù)合培養(yǎng)后7d，材料表面有較多細(xì)胞附著，細(xì)胞多呈球狀，斷面孔隙內(nèi)散在球形細(xì)胞，細(xì)胞跨越于孔隙中；A組及對(duì)照組兩組材料表面和內(nèi)部細(xì)胞貼附明顯減少。 結(jié)論 BG材料能與成骨細(xì)胞良好粘附，具有良好的細(xì)胞相容性，未見(jiàn)細(xì)胞毒性，黏附及增殖與材料的性能(包括化學(xué)組成、納米團(tuán)簇，表面積，孔徑及孔隙率)密切相關(guān)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示以溶膠－凝膠法制備58S和77S為粉體制成的