綠熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成內(nèi)皮細(xì)胞的研究.pdf

1、血管組織工程(vesseltissueengineering)研究的重點(diǎn)問(wèn)題之一是種子細(xì)胞，種子細(xì)胞來(lái)源缺乏是組織工程中的一大難題。內(nèi)皮細(xì)胞作為種子細(xì)胞在血管組織工程研究中具有重要作用，如何獲取足量的內(nèi)皮細(xì)胞是目前有待解決的問(wèn)題。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞因具有取材方便、對(duì)機(jī)體無(wú)害、自體移植不存在免疫排斥問(wèn)題以及分化類型廣泛等突出優(yōu)勢(shì)而有望成為血管組織工程中種子細(xì)胞的新來(lái)源。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化機(jī)制和誘導(dǎo)條件目前尚未闡明。多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為，其與骨髓

2、間充質(zhì)干細(xì)胞所處的微環(huán)境密切相關(guān)，可能是微環(huán)境中所含的各種因子促成了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向該環(huán)境所需要的細(xì)胞或組織分化。已有研究表明高表達(dá)的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血流剪切力在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的定向分化中均有顯著作用，但如何采用合理有效的誘導(dǎo)方式有待于進(jìn)一步的探討。 目的:研究綠熒光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSCs)體外分離培養(yǎng)

3、及擴(kuò)增能力，探討其骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在不同誘導(dǎo)條件和方式下向內(nèi)皮細(xì)胞定向分化能力，為在體研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法:選用GFP小鼠作為研究對(duì)象，分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并在體外進(jìn)行細(xì)胞的擴(kuò)增和傳代;應(yīng)用VEGFcDNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和直接添加VEGF的方法對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，并比較兩者對(duì)GFP小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的作用，對(duì)其結(jié)果進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞比例，統(tǒng)計(jì)分析。選出高效的誘導(dǎo)方式;分組誘導(dǎo)，實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)

4、實(shí)驗(yàn)組，即①切應(yīng)力組：直接置于平行板流動(dòng)腔內(nèi)應(yīng)用切應(yīng)力(8dyn/cm2)誘導(dǎo)24h；②轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)靜止組：將MSCs細(xì)胞行VEGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)培養(yǎng)；③轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)切應(yīng)力組：將MSCs細(xì)胞行VEGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)后置于平行板流動(dòng)腔內(nèi)在切應(yīng)力條件下(8dyn/cm2)誘導(dǎo)24h。之后再將各組細(xì)胞分別置于培養(yǎng)板培養(yǎng)1，3，5，7，10天，免疫熒光檢測(cè)其分化效果。 結(jié)果:MSCs每擴(kuò)增一代，細(xì)胞數(shù)量增加4～8倍，7.0×103個(gè)原代MSCs

5、體外擴(kuò)增3代即獲得1.4×108個(gè)細(xì)胞。連續(xù)傳代10代后仍可保持旺盛的分裂能力，說(shuō)明GFP小鼠MSCs具有良好的體外的培養(yǎng)擴(kuò)增的能力;直接添加濃度為25mg/1的VEGF誘導(dǎo)時(shí)，隨著時(shí)間推移，vWF陽(yáng)性細(xì)胞比例逐步上升，其轉(zhuǎn)化率在添加誘導(dǎo)劑3d時(shí)達(dá)到高峰，而后逐步平穩(wěn)下降。用免疫熒光法檢測(cè)在添加誘導(dǎo)劑1、3、5、7、10d時(shí)MSCs分化為vWF陽(yáng)性細(xì)胞比例分別為2.1％、23.3％、25.7％、23.5％、和21.8％。而經(jīng)VEGFcD

6、NA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)，隨著時(shí)間推移，vWF陽(yáng)性細(xì)胞比例穩(wěn)步上升，用免疫熒光法檢測(cè)誘導(dǎo)1、3、5、7、10d時(shí)MSCs分化為vWF陽(yáng)性細(xì)胞比例分別為1.3％、5.6％、14.4％、23.5％、和33.1％，其后期轉(zhuǎn)化率明顯高于直接添加VEGF的誘導(dǎo)組。以上結(jié)果說(shuō)明，GFP小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在VEGF的誘導(dǎo)下能有效地向內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化，但隨著時(shí)間的推移，其轉(zhuǎn)化效果逐步降低。而通過(guò)VEGFcDNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法使細(xì)胞自身表達(dá)VEGF，

7、可持續(xù)有效地促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干向內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化;檢測(cè)誘導(dǎo)后培養(yǎng)1，3，5，7，10天的切應(yīng)力組細(xì)胞，結(jié)果顯示在誘導(dǎo)3d時(shí)出現(xiàn)vWF表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞，說(shuō)明MSCs在流體切應(yīng)力的作用下可以轉(zhuǎn)化成內(nèi)皮細(xì)胞。而轉(zhuǎn)質(zhì)粒誘導(dǎo)切應(yīng)力組在轉(zhuǎn)質(zhì)粒誘導(dǎo)后，將MSCs移入平行板流動(dòng)腔以8dyn/cm2的流切力誘導(dǎo)24h，(對(duì)照轉(zhuǎn)質(zhì)粒組繼續(xù)靜止培養(yǎng)24h)。培養(yǎng)1、3、5、7、10天后對(duì)其結(jié)果進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，計(jì)算vWF陽(yáng)性細(xì)胞比例。用免疫熒光法檢測(cè)分化為vWF陽(yáng)性細(xì)

8、胞比例分別為2.1％、7.3％、20.8％、38.0％、和63.2％，與對(duì)照組差異顯著(P＜0.01)，說(shuō)明在流體剪切力作用MSCs轉(zhuǎn)化率明顯高于對(duì)照組。結(jié)果表明，流體剪切力對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化有明顯促進(jìn)作用。 結(jié)論:GFP小鼠MSCs在VEGF作用下可以向ECs轉(zhuǎn)化，其轉(zhuǎn)化效果隨著VEGF因子的降解而降低；而VEGFcDNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法可長(zhǎng)期有效地促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干向內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化;流體剪切力對(duì)骨髓間充質(zhì)干向內(nèi)皮細(xì)胞