增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化成心肌樣細(xì)胞研究.pdf

1、目的: 探討增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的可行性，明確經(jīng)蛋白標(biāo)記后的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcell，MSC)是否可以穩(wěn)定生長并被誘導(dǎo)成為心肌細(xì)胞以及心肌微環(huán)境對轉(zhuǎn)染MSC在體外向心肌樣細(xì)胞分化的影響，為進(jìn)一步做標(biāo)記的MSC體內(nèi)移植研究奠定基礎(chǔ)。 方法: 1、提取、鑒定pEGFP質(zhì)粒； 2、大鼠骨髓間

2、充質(zhì)干細(xì)胞的的分離和培養(yǎng)； 3、新生乳鼠心肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng)； 4、制備心肌細(xì)胞裂解液； 5、EGFP基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 6、篩選陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞后在熒光顯微鏡觀察，然后對比建系，并體外誘導(dǎo)其向心肌樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化； 7、把誘導(dǎo)的細(xì)胞做免疫組化檢測心臟特異性肌鈣蛋白T(cTnT)、α—肌動蛋白、連接蛋白43及CD31的表達(dá)情況，通過計(jì)算機(jī)分析系統(tǒng)測定其陽性率。 結(jié)果: 原代MSC多呈

3、紡錘形或梭形，有聚集生長的傾向，3～5個(gè)細(xì)胞成為一個(gè)集落。傳代后，細(xì)胞變?yōu)樾螒B(tài)均一的排列有序的成纖維細(xì)胞樣，長梭形，胞漿突起較少，胞體輪廓不甚清晰，胞體也相對較大；在脂質(zhì)體介導(dǎo)下將EGFP基因?qū)隡SC，在熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞的生長和增殖不受影響。增強(qiáng)型綠色熒光蛋白在基因轉(zhuǎn)染12h后開始表達(dá)，48～72h達(dá)高峰。在1周內(nèi)有較強(qiáng)的表達(dá)。1周后表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞逐漸減少，到4周時(shí)仍可見少量散在的熒光。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染率達(dá)20％～30％。質(zhì)粒和脂質(zhì)