腺病毒介導(dǎo)突變型HIF-1α基因?qū)w外誘導(dǎo)環(huán)境人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化成心肌樣細(xì)胞的影響.pdf

1、本實驗構(gòu)建了攜突變型HIF-1α基因的重組腺病毒載體，通過轉(zhuǎn)染體外誘導(dǎo)培養(yǎng)hMSCs，研究HIF-1α表達或增強其表達后對5-aza誘導(dǎo)hMSCs成為心肌樣細(xì)胞過程的影響，以進一步明確HIF-1α的心臟保護活性，為進一步研究HIF-1α基因及其突變型對缺血性心臟病的血管新生作用及以后的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本課題分四個部分進行研究。 方法 第一部分：本課題組所構(gòu)建的重組腺病毒載體HIF-1α<,nature>、Ad-HIF-

2、1α<,564>、Ad-HIF-1α<,564/402>和Ad-HIF-1α<,564/803>連同對照病毒Ad-LacZ，在HEK293細(xì)胞內(nèi)大量擴增后終點稀釋實驗法測定病毒滴度，再經(jīng)氯化銫梯度離心法純化；采用PCR方法對純化后病毒所攜突變型HIF-1α基因進行完整性鑒定；采用掃描電鏡對純化后病毒進行形態(tài)學(xué)鑒定；以Ad-LacZl感染HEK293細(xì)胞，經(jīng)X-gal染色確定轉(zhuǎn)染效率；重組腺病毒Ad-LacZ、Ad-HIF-1α<,nat

3、ure>、Ad-HIF-1α<,564>、Ad-HIF-1α<,564/402>和Ad-HIF-1α<,564/803>體外轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞評價其生物安全性。 第二部分：取本院成人檢查骨髓正常結(jié)果的骨髓標(biāo)本。按Pittenger的方法，分離骨髓標(biāo)本，取單個核細(xì)胞層培養(yǎng)、傳代。取第1、5、10代的貼壁細(xì)胞達到80-90％融合后，流式細(xì)胞儀Becton Dickinson FACScan檢測FITC-Anti-HLA-DR/CD13

4、-PE；FITC-CD45/CD34-PE；FITC-CD44/CD29-PE的表達。1 μmol/L地塞米松、0.5mmol/L IBMX，10μg/ml胰島素的條件定向誘導(dǎo)hMSCs向脂肪細(xì)胞分化，第14 d實驗組與對照組均行油紅O染色。0.1μmol/L地塞米松，10mmol/Lβ-甘油磷酸，50μmol/L Vit.C條件定向誘導(dǎo)hMSCs向成骨細(xì)胞分化。第28 d Von Kossa’s染色及茜素紅染色顯示鈣鹽沉著。第三部分：

5、用終濃度為10μmol/L 5-aza對第5代達到對數(shù)生長期的hMSCs進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，作用24h，誘導(dǎo)后培養(yǎng)使用含5％胎牛血清DMEM-LG培養(yǎng)基，每3-4d酌情換液。誘導(dǎo)培養(yǎng)第28 d收獲細(xì)胞，用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測肌系細(xì)胞的標(biāo)記抗原及心肌特異性標(biāo)記抗原：α-Actin、Connexin 43和心肌肌鈣蛋白T(cardiactroponin T，cTnT)。 第四部分：Ad-LacZ感染hMSCs，經(jīng)X-gal染色確定轉(zhuǎn)染效率

6、；重組腺病毒Ad-LacZ、Ad-HIF-1α<,nature>、Ad-HIF-1α<,564>、Ad-HIF-1α<,564/402>和Ad-HIF-1α<,564/803>以最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)轉(zhuǎn)染hMSCs后用5-aza對其進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，分別于誘導(dǎo)培養(yǎng)后的第14、28、32d，提取細(xì)胞漿蛋白行cTnI檢測。誘導(dǎo)的第28 d提取細(xì)胞漿蛋白，用Westernblot方法檢測HIF-1α和VEGF蛋白表達水平。 結(jié)果 第一部分：

7、在HEK293細(xì)胞內(nèi)擴增后的重組腺病毒Ad-LacZ、Ad-HIF-1α<,natrue>Ad-HIF-1α<,564>、Ad-HIF-1α<,564/402>和Ad-HIF-1α<,564/803>的滴度分別為1.99×10<'12> pfu/ml、6.31×10<'12>pfu/ml、3.98×10<'12> pfu/ml、10.0×10<'12> pfu/ml和1.26×10<'12> pfu/ml；經(jīng)氯化銫梯度離心法純化后滴度分

8、別為(7.755±0.477)×10<'11>OPU/ml、(5.077±0.188)×10<'11>OPU/ml、(6.848±0.129)×10<'11>OPU/ml、(6.292±0.260)×10<'11>OPU/ml和(6.193±0.221)×10<'11>OPU/ml；純化后病毒PCR檢測腺病毒骨架及所攜HIF-1α基因均得到預(yù)期的287bp、380bp、460bp和214bp擴增產(chǎn)物，且DNA測序結(jié)果符合實驗設(shè)計要求；電

9、鏡結(jié)果顯示腺病毒形態(tài)學(xué)特點，無支原體、衣原體污染；轉(zhuǎn)染HEK293后X-gal染色顯示，最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)為50 pfu/cell。 第二部分：㈠、hMSCs的分離、培養(yǎng)：Ficoll分離液(1.077g/ml)分離得到的單個核細(xì)胞24 h后貼壁，細(xì)胞呈圓形，48-72 h后呈紡錘形、梭形、多角形，增殖迅速，原代培養(yǎng)約14-20 d可達到80-90％融合。傳代細(xì)胞24 h內(nèi)完全貼壁，5-7 d內(nèi)達到80-90％融合。并傳代至第7-10

10、代。㈢、流式細(xì)胞儀檢測表面標(biāo)記物：生長良好的貼壁細(xì)胞在第1、5、10代時行表面標(biāo)記物檢測。第5代細(xì)胞均一性達到94％左右。CD34、CD45、HLA-DR陰性但CD13，CD29和CD44陽性。㈢、定向誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞：第3 d起光鏡下可見脂滴沉著的細(xì)胞，外形變?yōu)閳A形，橢圓形，第14 d油紅O染色示胞核呈藍(lán)色，脂滴呈橙紅色。隨著時間延長，脂肪細(xì)胞比例逐漸增高。對照組無脂滴出現(xiàn)。㈣、定向誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞：細(xì)胞呈現(xiàn)立方形外觀。Von Kossa

11、’s染色及茜素紅染色均能顯示礦化物(鈣鹽)的沉積，而且隨著誘導(dǎo)時間的延長不斷增高。對照組無礦化物(鈣鹽)的沉積。 第三部分：10μmol/L 5-aza誘導(dǎo)后，細(xì)胞形態(tài)變大，排列方向更趨一致，細(xì)胞增殖減慢，部分細(xì)胞脫壁死亡，2-3 W可見少數(shù)細(xì)胞胞體粗大，呈長方形。5-aza誘導(dǎo)培養(yǎng)28 d的爬片細(xì)胞經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測肌系細(xì)胞標(biāo)志，顯示部分誘導(dǎo)細(xì)胞表達α-Actin，Connexin 43和cTnT，陽性細(xì)胞率分別為(32.

12、27±13.17)％、(29.51±5.22)％和(19.96±4.01)％。在未經(jīng)5-aza誘導(dǎo)的同培養(yǎng)天數(shù)的hMSCs中未見表達。 第四部分：隨著MOI值的升高，Ad-LacZ的轉(zhuǎn)染效率和基因表達增強，在MOI值為75 OPU/cell時，Ad-LacZ轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞的效率高于90％。誘導(dǎo)的第14、28、32 d，Ad-LacZ、Ad-HIF-1α<,nature>、Ad-HIF-1α<,564>、Ad-HIF-1α<,564

13、/402>和Ad-HIF-1α<,564/803>四組均促進hMSCs向心肌樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，與對照Ad-LacZ組相比差異有顯著性(P=0.000)，Ad-HIF-1α<,nature>、Ad-HIF-1α<,564>和Ad-HIF-1α<,564/402>三組cTnI值，與Ad-HIF-1α<,564/803>相比，亦有顯著性差異，P值分別為0.001、0.001以及0.021。但是Ad-HIF-1α<,natrue>、Ad—HIF-1α

14、<,564>和Ad-HIF-1α<,564/402>組間差異無顯著性，P值分別為0.974、0.229和0.217。Western blot結(jié)果顯示Ad-HIF-1α<,nature>、Ad-HIF-1α<,564>、Ad-HIF-1α<,564/402>、Ad-HIF-1α<,564/803>四組HIF-1α蛋白表達水平較Ad-LacZ組高。VEGF蛋白表達也上升。 結(jié)論 第一部分：本課題組構(gòu)建的重組腺病毒載體Ad-L

15、acZ、Ad-HIF-1α<,nature>、Ad-HIF-1α<,564>、Ad-HIF-1α<,564/402>和Ad-HIF-1α<,2564/803>滴度高、轉(zhuǎn)染效率高且安全，為下一步實驗提供了保證。 第二部分：骨髓分離、培養(yǎng)hMSCs獲得成功，依據(jù)如下：(一)、從骨髓分離、培養(yǎng)單個核細(xì)胞呈貼壁生長，成纖維細(xì)胞樣外觀。(二)、高表達CD13、CD29和CD44．CD34、CD45和HLA-DR表達極低。(三)、可以被定向