改性的PHBV膜與大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的相容性.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　 組織工程學(xué)是應(yīng)用生物學(xué)和工程學(xué)的原理研究開發(fā)能夠修復(fù)、重建或改善病損組織形態(tài)和功能的生物替代物的一門學(xué)科。目前，應(yīng)用組織工程方法已經(jīng)制備出人工骨、軟骨、皮膚、肌腱、血管甚至人工胰、人工肝等。我國(guó)骨組織工程研究進(jìn)展較快，已經(jīng)利用組織工程化骨修復(fù)顱骨缺損獲得成功。骨再生的形狀與數(shù)量與骨膜下空間有關(guān)，是骨組織再生的重要問(wèn)題之一。此外，在骨組織工程研究中還存在許多難題，理想的細(xì)胞外基質(zhì)材料的選擇和制備是骨組織工程中十分

2、重要的任務(wù)，也是組織工程化骨組織能否應(yīng)用于臨床的重要影響因素。
　　 理想的骨組織工程細(xì)胞外基質(zhì)材料應(yīng)具備:1.良好的生物相容性:除無(wú)毒、不致畸和致癌之外，還要有利于種子細(xì)胞的黏附、增殖和降解產(chǎn)物能及時(shí)排除，利于種子細(xì)胞的融合生長(zhǎng)，無(wú)炎癥反應(yīng)，不抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。2.良好的生物降解性:基質(zhì)材料在完成支架作用后應(yīng)能降解，降解率應(yīng)與組織細(xì)胞生長(zhǎng)率相匹配，降解時(shí)間應(yīng)能根據(jù)組織生長(zhǎng)特性可以進(jìn)行人工調(diào)控。3.具有三維立體多孔結(jié)構(gòu):基質(zhì)

3、材料可加工成三維立體結(jié)構(gòu)，孔隙率最好達(dá)90％以上，具有較高的面積體積比。這種結(jié)構(gòu)可提供寬大的表面積和空間，利于細(xì)胞黏附，細(xì)胞外基質(zhì)沉積，營(yíng)養(yǎng)和氧氣進(jìn)入，代謝產(chǎn)物排出和細(xì)胞的生長(zhǎng)。4.可塑性和機(jī)械強(qiáng)度:基質(zhì)材料應(yīng)具有良好的可塑性，可預(yù)先制作成一定形狀，并具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，為新生組織提供支撐，并能保持一定長(zhǎng)度的時(shí)間，直至新生組織具有自身生物力學(xué)特性。5.良好的材料-細(xì)胞界面:材料應(yīng)能提供良好的材料細(xì)胞融合作用界面，利于細(xì)胞黏附、生長(zhǎng)，更重

4、要的是材料應(yīng)能激活細(xì)胞特異基因表達(dá)，維持正常細(xì)胞的表型表達(dá)。
　　 人工合成高分子材料具有良好的可降解吸收性，同時(shí)其組成和結(jié)構(gòu)、機(jī)械性能以及材料的降解時(shí)間等都能預(yù)先設(shè)計(jì)和調(diào)控，因此是組織工程材料中研究最多、應(yīng)用最廣的支架材料。PHBV生物可降解高分子材料的應(yīng)用是生物醫(yī)學(xué)工程材料的重大進(jìn)展。因其具備良好的生物相容性、完全的生物可降解性、穩(wěn)定的壓電特性，目前研究已證明PHBV可用于藥物緩釋載體、組織工程支架材料、構(gòu)建心臟生物瓣膜、引

5、導(dǎo)膜再生骨和手術(shù)縫合線等。
　　 但是PHBV的脆性仍然很大，原因在于它的純度較高，球晶尺寸較大。對(duì)于PHBV來(lái)說(shuō)，當(dāng)HV摩爾含量較低時(shí)(≤0.12)，它的斷裂伸長(zhǎng)率只有6％左右，在拉伸條件下能成晶和流動(dòng)。由于PHB和PHBV的高純度，結(jié)晶成核密度比較低，室溫下能夠二次結(jié)晶，結(jié)晶度比較高，結(jié)晶速度比較慢易生成大尺寸的球晶。以球晶中心向外擴(kuò)展形成許多圓環(huán)狀的開裂以及沿球晶生長(zhǎng)方向形成許多劈裂，從而導(dǎo)致了PHBV呈脆性斷裂。另外，P

6、HBV的機(jī)械性能差，骨結(jié)合力弱更是需要解決的問(wèn)題。進(jìn)一步提高PHBV共聚物的生物相容性并增強(qiáng)其耐腐蝕性能，使其能夠作為骨損傷后的固定材料和骨組織工程的支架材料，是本實(shí)驗(yàn)研究的主要問(wèn)題。
　　 通過(guò)探索溶解在PHBV中的不同濃度的3-(4-羥基-3-甲氧苯基)-2-丙烯酸對(duì)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖作用，制備出具有最佳濃度的3-(4-羥基-3-甲氧苯基)-2-丙烯酸PHBV，構(gòu)建成具有立體化的三維組織工程支架，在體外將其與骨髓間

7、充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)變化、細(xì)胞活力、細(xì)胞周期等各項(xiàng)指標(biāo)，以探討表面改性的PHBV膜與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞融合的新型人造膜狀組織替代物的可行性。為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 SPF級(jí)健康成年SD大鼠(100-120g)，頸椎離斷處死，全骨髓培養(yǎng)法分離出均質(zhì)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。將第三代細(xì)胞離心，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面cd34、cd44、cd90、cd11b抗原并進(jìn)行鑒定。PHBV與

8、甲苯攪拌均勻，用注射器抽取成膜液注入直徑9cm的玻璃培養(yǎng)皿，真空干燥機(jī)室溫下干燥成厚度為0.5mm的薄膜。將其分為4組，分別是:0％阿魏酸處理組、5％阿魏酸處理組、10％阿魏酸處理組、15％阿魏酸處理組。將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與改性的PHBV膜復(fù)合培養(yǎng)，用掃描電鏡觀察材料表面細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)形態(tài)變化。制備浸提液，用浸提液培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、細(xì)胞活力檢測(cè)（MTT法）、細(xì)胞周期檢測(cè)等多種方法，綜合分析骨髓間充質(zhì)干細(xì)

9、胞與經(jīng)阿魏酸處理的PHBV膜的體外組織相容性。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 經(jīng)過(guò)原代培養(yǎng)5d后，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞融合成單層。倒置顯微鏡觀察，見骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞呈梭形貼壁生長(zhǎng)，大小均勻，大量生長(zhǎng)時(shí)細(xì)胞排列呈漩渦狀。接觸抑制現(xiàn)象不明顯，呈現(xiàn)出常見的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特征。流式細(xì)胞儀表型分析結(jié)果，所獲得的BMSCs均質(zhì)性好，低表達(dá)淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志CD11b、造血干細(xì)胞表面標(biāo)志CD34;高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志CD44、CD90。<

10、br>　　 掃描電鏡觀察可見:PHBV膜的材料表面結(jié)構(gòu)平整，有利于細(xì)胞生長(zhǎng)。分別與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)6h、12h、24h后，在各組材料表面均有細(xì)胞黏附，細(xì)胞呈梭形或多角形，伸出偽足黏附于材料上。其中，0％和5％阿魏酸處理的材料表面的細(xì)胞呈跨越生長(zhǎng)，并覆蓋材料表面孔隙生長(zhǎng)，細(xì)胞連接增多，細(xì)胞表面有微絨毛出現(xiàn)，說(shuō)明細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。而10％和15％阿魏酸處理組材料表面細(xì)胞數(shù)量較稀疏，生長(zhǎng)的偽足不明顯。
　　 細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果

11、顯示:PHBV組和各對(duì)照組的吸光度值都隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高(P＜0.05)。5％阿魏酸處理的材料的吸光度值高于其他各組(P＜0.05)，陰性對(duì)照組的吸光度值低于其他各組(P＜0.05)。
　　 細(xì)胞周期法檢測(cè)結(jié)果顯示:PHBV組和各對(duì)比組的細(xì)胞增殖指數(shù)，即（S期+G2期）百分比均隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增高(p＜0.05)。5％阿魏酸處理的細(xì)胞增殖指數(shù)高于其他各組(p＜0.05)，PLA陰性對(duì)照組的細(xì)胞增殖指數(shù)低于其他各組(p＜0.05