不同孔徑的磷酸鈣骨水泥對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物相容性影響差異的研究.pdf

1、背景：大段骨缺損的修復(fù)一直是臨床上所面臨的難題，骨組織工程的研究和發(fā)展為大段骨缺損的修復(fù)提供了一條良好的途徑，相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道利用支架材料復(fù)合生長(zhǎng)因子以及種子細(xì)胞配合適宜的體內(nèi)力學(xué)環(huán)境可有效的修復(fù)大段骨缺損模型，但是不同結(jié)構(gòu)、組成的支架材料植入體內(nèi)后新生骨組織長(zhǎng)入速率存在很大的差異。研究表明，材料結(jié)構(gòu)可以明顯影響骨組織的長(zhǎng)入速度，而孔隙率和孔徑大小又是其中最為重要的影響因素。因此研究不同孔徑大小的支架材料對(duì)大段骨缺損的治療顯得尤為重要。

2、本研究采用三種孔徑大小(200-300μm、300-450μm、450-600μm)的磷酸鈣骨水泥材料與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)的方法，觀察材料表面的細(xì)胞黏附、增殖和分化能力的差異，分析材料孔徑結(jié)構(gòu)在促進(jìn)骨折愈合機(jī)制中的作用。
　　實(shí)驗(yàn)一CPC材料的孔徑大小與大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞黏附能力之間的關(guān)系
　　目的：評(píng)價(jià)不同大小孔徑的磷酸鈣骨水泥(Calciumphosphatecement,CPC)材料對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

3、(Bonemesenchymalstemcells,BMSCs)黏附能力的影響。方法：用鹽析法制備三種不同孔徑的(200-300μm、300-450μm、450-600μm)CPC材料，利用Micro-CT測(cè)量三種材料的平均孔徑、孔隙率。無(wú)菌條件下取新生大鼠BMSCs原代培養(yǎng)并傳代；將三組材料分別放置于24孔板內(nèi)，每個(gè)材料接種2×105個(gè)細(xì)胞后，37℃、飽和濕度環(huán)境下靜置培養(yǎng)。于接種后第12h、24h收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞黏附率；并在

4、第24h收集細(xì)胞行AnnexinVFITC/PI雙標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡、壞死檢測(cè)，并利用掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及黏附情況。結(jié)果：micro-CT測(cè)量結(jié)果顯示：三種CPC材料孔徑間相互連通，孔隙率均大于67％，平均孔徑分別為240μm、410μm、510μm。第12h，三種材料表面細(xì)胞黏附率及壞死率均無(wú)明顯差別(P＞0.05)；200-300μm組在第24h細(xì)胞黏附量明顯少于300-450μm組和450-600μm組，差值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

5、意義(P＜0.05)；200-300μm組材料表面細(xì)胞壞死數(shù)量明顯多于450-600μm組，(P＜0.05)。結(jié)論：孔徑大小可影響大鼠BMSCs在多孔CPC材料上的黏附能力，隨著孔徑增大，細(xì)胞黏附率逐漸增高，細(xì)胞壞死率逐漸降低。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究孔徑結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞的增殖、分化提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)二不同孔徑CPC材料對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響
　　目的：評(píng)價(jià)不同大小孔徑的磷酸鈣骨水泥(Calciumphosphatec

6、ement,CPC)材料對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力的影響。方法：將三種不同孔徑的(200-300μm、300-450μm、450-600μm)CPC材料分為三組，每個(gè)材料接種P3代大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞5×104個(gè)細(xì)胞，37℃、飽和濕度環(huán)境下靜置培養(yǎng)。于接種后第1、4、7、14、21天用PICOGREEN細(xì)胞繁殖定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞增殖率，并在第14天、21天用戊二醛固定材料，梯度脫水、干燥噴金，利用掃描電鏡觀察材料表面細(xì)胞生長(zhǎng)情況。結(jié)

7、果：細(xì)胞在三組材料上均呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)趨勢(shì)，第14天左右即到達(dá)平臺(tái)期，在第1天三組細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯差異，第4天大孔徑(450-600μm)材料組細(xì)胞數(shù)量明顯高于其余兩組(P＜0.05)，在第7天細(xì)胞數(shù)量隨孔徑的增加依次增加，3組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，第14天和第21天200-300μm組細(xì)胞數(shù)量明顯少于其余兩組(300～450μm、450～600μm)(P＜0.05)，300-450μm組和450-600μm組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0

8、.05)。結(jié)論：材料孔徑結(jié)構(gòu)可影響大鼠BMSCs在多孔CPC材料上的增殖能力，大孔徑材料較小孔徑材料更利于細(xì)胞增殖。為進(jìn)一步研究孔徑結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞的成骨分化提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)三不同孔徑CPC材料對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響
　　目的：評(píng)價(jià)不同大小孔徑的磷酸鈣骨水泥(Calciumphosphatecement,CPC)材料對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力的影響。方法：將三種不同孔徑的(200-300μm、300

9、-450μm、450-600μm)CPC材料分為三組，每個(gè)材料接種P3代大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞5×104個(gè)細(xì)胞，37℃、飽和濕度環(huán)境下靜置，成骨培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)。于接種后第47、14、21天用ALP活性測(cè)定試劑盒測(cè)定細(xì)胞ALP活性；并提取總RNA，qRT-PCR測(cè)定成骨相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果：通過(guò)堿性磷酸酶活性測(cè)定以及qRT-PCR測(cè)定5對(duì)成骨基因顯示：在200-300μm孔徑CPC材料組表面細(xì)胞成骨分化程度明顯好于其余兩組(P＜0.05)。結(jié)論