納米晶膠原基骨-血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子緩釋支架與人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外生物相容性研究.pdf

1、組織工程研究中利用載體或緩釋系統(tǒng)負(fù)載生長(zhǎng)因子,既能保護(hù)生長(zhǎng)因子的生物活性,又可以使生長(zhǎng)因子緩慢釋放,從而持續(xù)促進(jìn)相關(guān)細(xì)胞生長(zhǎng)及組織修復(fù)再生,是目前控制釋放支架材料應(yīng)用研究的方向之一。清華大學(xué)材料系研制的納米晶膠原基骨(nanoHydroxyapatite／collagen,nHAC)具有與天然松質(zhì)骨類(lèi)似的三維孔洞網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),已做為一種較好支架材料用于組織工程研究；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth f

2、actor,VEGF)是一種具有特異性促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)和血管生成的誘導(dǎo)因子,可以明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖,在骨損傷修復(fù)中具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)利用生物學(xué)方法將VEGF負(fù)載于n HAC上,觀察該復(fù)合支架中VEGF的緩釋效果的和對(duì)成骨誘導(dǎo)的入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)黏附及增殖的影響,了解二者生物相容性,旨在通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)為骨組織工程尋求一種新型復(fù)合支架材料.
　　 第一部分納

3、米晶膠原基骨／血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子緩釋支架的實(shí)驗(yàn)研究
　　 材料和方法:nHAC用無(wú)水酒精浸泡預(yù)處理后,再經(jīng)不同基質(zhì)表面修飾后加入VEGF,制備緩釋支架。實(shí)驗(yàn)分為四組:實(shí)驗(yàn)組A:nHAC、纖維連接蛋白(fibronectin,FN)、肝素(heparin,HP)和VEGF(nHAC-FN-HP-VEGF)；對(duì)照組B:nHAC、FN和VEGF(nHAC-FN-VEGF)；對(duì)照組C,n HAC、HP和VEGF(nHAC-HP-VEGF)

4、；對(duì)照組D:nHAC和VEGF(nHAC-VEGF)。將VEGF配制成濃度為0.1mg／ml溶液,等量滴加于支架材料上制備緩釋系統(tǒng)。體外用磷酸鹽緩沖溶液(phosphate bufferedsolution,PBS)浸泡支架,應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定方法(enzyme linkedimmunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組相同時(shí)間點(diǎn)緩釋液內(nèi)的VEGF含量,繪制釋放曲線(xiàn),確定釋放時(shí)間,比較分析各種緩釋系統(tǒng)緩釋效果的差異

5、。
　　 結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組A的VEGF緩釋量最高,持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)(可達(dá)14d),與其他各組相比有顯著性差異；
　　 結(jié)論:肝素和纖維連接蛋白修飾后的nHAC與VEGF構(gòu)建的nHAC-FN-HP-VEGF緩釋支架具有更長(zhǎng)、更穩(wěn)定的釋放能力。
　　 第二部分納米晶膠原基骨／血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子緩釋支架對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外粘附增殖的影響
　　 材料和方法:取健康成年男性骨髓,密度梯度離心法分離有核細(xì)胞層,得均一性較好

6、的hMSCs,傳代培養(yǎng)至第三代后經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)、擴(kuò)增,并進(jìn)行成骨細(xì)胞表型鑒定后,種植于四種緩釋支架材料體外復(fù)合培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)分為四組:實(shí)驗(yàn)組A:結(jié)合有纖維連接蛋白(FN)、肝素(HP)和VEGF的納米晶膠原基骨復(fù)合支架(nHAC-FN-HP-VEGF)；對(duì)照組B:結(jié)合有纖維連接蛋白及VEGF的納米晶膠原基骨復(fù)合支架(nHAC-FN-VEGF)；對(duì)照組C:結(jié)合有肝素和VEGF的納米晶膠原基骨復(fù)合支架(nHAC-HP-VEGF)；對(duì)照組D:結(jié)合

7、有VEGF的納米晶膠原基骨支架(nHAC-VEGF)。通過(guò)檢測(cè)緩釋支架材料上種植細(xì)胞后細(xì)胞的黏附率、不同時(shí)間點(diǎn)(3、7、10、14d)支架材料中細(xì)胞數(shù)、堿性磷酸酶活性以及掃描電鏡觀察細(xì)胞在材料上的生長(zhǎng)狀況,比較分析不同緩釋支架材料與細(xì)胞生物相容性差異。
　　 結(jié)果:第三代hMSCs經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)14d后,堿性磷酸酶細(xì)胞化學(xué)染色、Ⅰ型膠原免疫熒光染色均為陽(yáng)性；實(shí)驗(yàn)組A的細(xì)胞黏附率最高,為61.8％；各組支架中的細(xì)胞數(shù)量均隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)

8、而增長(zhǎng),實(shí)驗(yàn)組A的細(xì)胞數(shù)增加較快,與相同時(shí)間點(diǎn)其他各組材料中細(xì)胞數(shù)差異有顯著性(P<0.05)；各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞堿性磷酸酶活性表達(dá)實(shí)驗(yàn)組A最高,差異亦有顯著性(P<0.05)。電鏡掃描發(fā)現(xiàn)4組材料上細(xì)胞生長(zhǎng)良好,但以實(shí)驗(yàn)組A的細(xì)胞增殖、分化狀況明顯好于其他組。
　　 結(jié)論:hMSCs經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后可具有成骨細(xì)胞特性,nHAC-FN-HP-VEGF緩釋支架與hMSCs具有較好生物相容性,能顯著提高細(xì)胞的粘附和增殖,可作為較理想的新型復(fù)合