骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2-注射式硫酸鈣緩釋載體與大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外生物相容性研究.pdf

1、骨組織工程在解決臨床骨缺損這一棘手問(wèn)題上具有許多優(yōu)勢(shì),是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。良好的支架材料和生長(zhǎng)因子對(duì)細(xì)胞的粘附,增殖、分化具有決定性作用。然而生長(zhǎng)因子存在穩(wěn)定性差、半衰期短等不足,限制了其臨床應(yīng)用,利用載體或緩釋系統(tǒng)負(fù)載生長(zhǎng)因子,既能保護(hù)生長(zhǎng)因子的生物活性,又可以使生長(zhǎng)因子緩慢釋放,從而持續(xù)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)及組織修復(fù)再生,因而控釋載體材料的應(yīng)用是目前組織工程研究的熱點(diǎn)。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(Bonemorphogeneticprotein-2

2、,BMP-2)能誘導(dǎo)和加速M(fèi)SCs向成骨樣細(xì)胞分化。注射式硫酸鈣(InjectableCalciumSulfateCement,ICSC)是醫(yī)用半水硫酸鈣的衍生產(chǎn)品之一,可以作為支架材料搭載糖蛋白,氨基苷類抗生素。因此本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用骨組織工程學(xué)方法,將BMP-2負(fù)載于ICSC上,制備BMP-2緩釋載體,探討其緩釋性能以及對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖,分化的影響。旨在通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)為BMP-2尋找較理想的緩釋載體,為臨床修復(fù)骨缺損提供一種微創(chuàng)治療

3、方式。
　　 第一部分骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/注射式硫酸鈣緩釋載體對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨誘導(dǎo)的影響
　　 目的:研究骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BoneMorphogeneticProtein-2,BMP-2)/注射式硫酸鈣(InjectableCalciumSulfateCement,ICSC)復(fù)合載體對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MarrowMesenchymalStemCells,MSCs)的體外誘導(dǎo)成骨的影響。
　　

4、 材料和方法:頸椎脫臼處死SD大鼠,無(wú)菌條件下取其股骨、脛骨,用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔,沖出骨髓,淋巴細(xì)胞分離液分離后,常規(guī)傳代培養(yǎng)。取第三代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞,應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法測(cè)定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表型。種植于兩種載體體外復(fù)合培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分三組:實(shí)驗(yàn)組A:單純BMP-2;實(shí)驗(yàn)組B:BMP-2/ICSC;C組:空白對(duì)照組。通過(guò)檢測(cè)緩釋載體上種植細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)(3,7,10,14d)載體上細(xì)胞數(shù),堿性磷酸

5、酶活性,同時(shí)應(yīng)用堿性磷酸酶,茜素紅及馮庫(kù)薩染色對(duì)復(fù)合培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行成骨細(xì)胞表型鑒定。
　　 結(jié)果:第三代MSCs經(jīng)復(fù)合培養(yǎng)7d后,實(shí)驗(yàn)組A,B兩組堿性磷酸酶染色為陽(yáng)性,對(duì)照組陰性;三組載體中細(xì)胞數(shù)量均隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增長(zhǎng),實(shí)驗(yàn)組B的細(xì)胞數(shù)增加最快,與相同時(shí)間點(diǎn)其他各組材料中細(xì)胞數(shù)差異有顯著性(P＜0.05);各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞堿性磷酸酶活性表達(dá)實(shí)驗(yàn)組B最高,對(duì)照組最低,差異亦有顯著性(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)A,B馮庫(kù)薩,茜素紅染色均為陽(yáng)

6、性,C組陰性。
　　 結(jié)論:MSCs在BMP-2/ICSC載體上培養(yǎng)后可具有成骨細(xì)胞特性。該載體能誘導(dǎo)MSCs向成骨細(xì)胞分化,能夠保留BMP-2的生物活性,可以作為較理想的生長(zhǎng)因子載體應(yīng)用于骨組織工程。
　　 第二部分骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/注射式硫酸鈣緩釋載體與大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外生物相容性
　　 目的:觀察骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/注射式硫酸鈣緩釋系統(tǒng)的體外緩釋效果及與種子細(xì)胞的生物相容性。
　　 材料和

7、方法:大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)、擴(kuò)增后種植于骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2/注射式硫酸鈣緩釋載體和單純的注射式硫酸鈣行體外培養(yǎng)。測(cè)定緩釋支架材料上骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的釋放量和持續(xù)時(shí)間;種植細(xì)胞后細(xì)胞的黏附率;培養(yǎng)3,7,10,14d時(shí)支架材料中細(xì)胞數(shù)、堿性磷酸酶活性,7d行堿性磷酸酶染色,14d行茜素紅染色和馮庫(kù)薩染色,并在掃描電鏡下觀察載體上細(xì)胞生長(zhǎng)情況。實(shí)驗(yàn)分兩組:實(shí)驗(yàn)組:BMP-2/ICSC;對(duì)照組:ICSC。體外用磷酸鹽緩沖溶液(

8、PhosphateBufferedSolution,PBS)浸泡支架,應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試劑測(cè)定方法(EnzymeLinkedImmuno-SorbentAssay,ELISA)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)緩釋液內(nèi)的BMP-2含量,繪制釋放曲線,確定釋放時(shí)間,評(píng)價(jià)載體緩釋性能。
　　 結(jié)果:該緩釋支架具有一定的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2緩釋效果,持續(xù)時(shí)間可達(dá)31d。第3代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng),可表達(dá)成骨細(xì)胞表型,實(shí)驗(yàn)組堿性磷酸酶細(xì)胞