Notch信號參與骨形態(tài)發(fā)生蛋白9誘導的間充質(zhì)干細胞成骨分化及其機制的初步探討.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)具有定向分化和自我更新的潛能，現(xiàn)已成為骨疾病治療中的熱點。骨形態(tài)發(fā)生蛋白9(bone morphogeneticprotein9，BMP9)對MSCs的成骨作用強于家族其他成員，且對其知之甚少。Notch信號調(diào)控著細胞的增長分化，并且協(xié)同BMP9誘導MSCs的早期成骨作用。本研究旨在明確BMP9對間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中的影響（第一部分），系統(tǒng)研究Notch信號在BMP9誘導間充質(zhì)干細胞成骨分化中的作用（第

2、二部分）以及其調(diào)節(jié)機制的初步探討（第三部分）。
　　第一部分、骨形態(tài)發(fā)生蛋白9對間充質(zhì)干細胞成骨分化的影響
　　目的:研究驗證BMP9對MSCs成骨分化過程的影響。
　　方法:利用腺病毒過表達載體(AdBMP9/AdGFP)分別處理C2C12細胞，用活性定量和細胞化學染色測定早期成骨指標堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase，ALP)，利用茜素紅S染色、免疫組化和RT-PCR檢測方法測定晚期成骨指標骨橋蛋白

3、(Osteopontin，OPN)、骨鈣素(Osteocalcin，OCN)和鈣鹽沉積。通過WB方法檢測BMP9經(jīng)典信號通路BMPs-Smad和非經(jīng)典信號通路BMPs-MAPK中主要胞漿蛋白的表達。
　　結果:AdBMP9處理細胞后，3、5、7天ALP活性以及7、14天鈣鹽沉積持續(xù)增加(P＜0.05)，并與AdBMP9呈劑量依賴性;同樣，7、9、11天OPN和OCN表達量持續(xù)上調(diào)(P＜0.05)。同時發(fā)現(xiàn)，BMPs經(jīng)典和非經(jīng)典通路

4、中Smad1/5/8、P38、Erk1/2、JNK的磷酸化蛋白表達水平均有上調(diào)(P＜0.05)，而總蛋白量則沒有明顯變化。
　　結論:BMP9可以同時激活BMPs經(jīng)典和非經(jīng)典信號通路，參與間充質(zhì)干細胞C2C12的成骨過程。
　　第二部分、Notch信號在BMP9誘導間充質(zhì)干細胞成骨分化中的作用
　　目的:研究明確Notch信號在BMP9誘導的間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中的作用。
　　方法:通過細胞密度激活實驗和使用

5、Notch信號抑制劑DAPT阻斷Notch信號探討Notch信號在BMP9誘導MSCs成骨分化過程中的作用;用細胞化學染色和活性測定早期成骨標志物ALP的表達;通過RT-PCR檢測晚期成骨標志物OCN的表達情況。
　　結果:AdBMP9處理C2C12細胞后，40％和80％細胞密度組ALP和Hey1表達量均高于20％組(P＜0.05);而后期檢OCN和Hey1表達量與20％組相比，無明顯變化;早期檢測DAPT抑制組中ALP活性以及H

6、ey1表達量明顯降低(P＜0.05)，晚期檢測DAPT組7、9、11天OCN的表達量與BMP9組相比均有所下調(diào)(P＜0.05)，而9、11天Hey1表達則無明顯變化。
　　結論:Notch信號能促進BMP9誘導的MSCs的成骨分化。
　　第三部分、Notch信號調(diào)節(jié)骨形態(tài)發(fā)生蛋白9誘導間充質(zhì)干細胞成骨分化機制的初步探討
　　目的:初步探討Notch信號參與BMP9誘導MSCs成骨分化過程的作用機制。
　　方法:使

7、用DAPT5d后，通過檢測胞膜上BMPs信號受體、胞漿中蛋白以及轉(zhuǎn)錄子，從胞膜、胞漿、胞核三方面研究其作用機制。
　　結果:AdBMP9處理C2C12細胞后，DAPT抑制組中ALK2受體下調(diào)，而其他受體無明顯變化;經(jīng)典通路中Smad1/5/8以及非經(jīng)典通路中Erk1/2、P38的磷酸化水平都有所降低(P＜0.05)。轉(zhuǎn)錄子Runx2、Colla-1以及BMPs靶基因Id1、Id2、Id3表達均有降低(P＜0.05)。
　　結