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文檔簡介
1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具有定向分化和自我更新的潛能,現(xiàn)已成為骨疾病治療中的熱點。骨形態(tài)發(fā)生蛋白9(bone morphogeneticprotein9,BMP9)對MSCs的成骨作用強(qiáng)于家族其他成員,且對其知之甚少。Notch信號調(diào)控著細(xì)胞的增長分化,并且協(xié)同BMP9誘導(dǎo)MSCs的早期成骨作用。本研究旨在明確BMP9對間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中的影響(第一部分),系統(tǒng)研究Notch信號在BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的作用(第
2、二部分)以及其調(diào)節(jié)機(jī)制的初步探討(第三部分)。
第一部分、骨形態(tài)發(fā)生蛋白9對間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響
目的:研究驗證BMP9對MSCs成骨分化過程的影響。
方法:利用腺病毒過表達(dá)載體(AdBMP9/AdGFP)分別處理C2C12細(xì)胞,用活性定量和細(xì)胞化學(xué)染色測定早期成骨指標(biāo)堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase,ALP),利用茜素紅S染色、免疫組化和RT-PCR檢測方法測定晚期成骨指標(biāo)骨橋蛋白
3、(Osteopontin,OPN)、骨鈣素(Osteocalcin,OCN)和鈣鹽沉積。通過WB方法檢測BMP9經(jīng)典信號通路BMPs-Smad和非經(jīng)典信號通路BMPs-MAPK中主要胞漿蛋白的表達(dá)。
結(jié)果:AdBMP9處理細(xì)胞后,3、5、7天ALP活性以及7、14天鈣鹽沉積持續(xù)增加(P<0.05),并與AdBMP9呈劑量依賴性;同樣,7、9、11天OPN和OCN表達(dá)量持續(xù)上調(diào)(P<0.05)。同時發(fā)現(xiàn),BMPs經(jīng)典和非經(jīng)典通路
4、中Smad1/5/8、P38、Erk1/2、JNK的磷酸化蛋白表達(dá)水平均有上調(diào)(P<0.05),而總蛋白量則沒有明顯變化。
結(jié)論:BMP9可以同時激活BMPs經(jīng)典和非經(jīng)典信號通路,參與間充質(zhì)干細(xì)胞C2C12的成骨過程。
第二部分、Notch信號在BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中的作用
目的:研究明確Notch信號在BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中的作用。
方法:通過細(xì)胞密度激活實驗和使用
5、Notch信號抑制劑DAPT阻斷Notch信號探討Notch信號在BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化過程中的作用;用細(xì)胞化學(xué)染色和活性測定早期成骨標(biāo)志物ALP的表達(dá);通過RT-PCR檢測晚期成骨標(biāo)志物OCN的表達(dá)情況。
結(jié)果:AdBMP9處理C2C12細(xì)胞后,40%和80%細(xì)胞密度組ALP和Hey1表達(dá)量均高于20%組(P<0.05);而后期檢OCN和Hey1表達(dá)量與20%組相比,無明顯變化;早期檢測DAPT抑制組中ALP活性以及H
6、ey1表達(dá)量明顯降低(P<0.05),晚期檢測DAPT組7、9、11天OCN的表達(dá)量與BMP9組相比均有所下調(diào)(P<0.05),而9、11天Hey1表達(dá)則無明顯變化。
結(jié)論:Notch信號能促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)的MSCs的成骨分化。
第三部分、Notch信號調(diào)節(jié)骨形態(tài)發(fā)生蛋白9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化機(jī)制的初步探討
目的:初步探討Notch信號參與BMP9誘導(dǎo)MSCs成骨分化過程的作用機(jī)制。
方法:使
7、用DAPT5d后,通過檢測胞膜上BMPs信號受體、胞漿中蛋白以及轉(zhuǎn)錄子,從胞膜、胞漿、胞核三方面研究其作用機(jī)制。
結(jié)果:AdBMP9處理C2C12細(xì)胞后,DAPT抑制組中ALK2受體下調(diào),而其他受體無明顯變化;經(jīng)典通路中Smad1/5/8以及非經(jīng)典通路中Erk1/2、P38的磷酸化水平都有所降低(P<0.05)。轉(zhuǎn)錄子Runx2、Colla-1以及BMPs靶基因Id1、Id2、Id3表達(dá)均有降低(P<0.05)。
結(jié)
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