hTERT和CTLA4Ig雙基因修飾人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為骨組織工程異基因種子細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景和目的： 嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染、腫瘤等原因所致的骨缺損是臨床常見的疑難問題，骨組織工程被認(rèn)為是修復(fù)骨缺損的理想方法，在將來的臨床中具有廣闊的應(yīng)用前景。種子細(xì)胞作為骨組織工程的最重要環(huán)節(jié)之一，近年來進(jìn)行了大量的研究，一般認(rèn)為，理想的骨組織工程種子細(xì)胞需要滿足三個(gè)基本條件： ①可靠的細(xì)胞來源，取材方便，易于體外擴(kuò)增； ②具有特定的分化表型或定向分化潛能； ③能夠適應(yīng)受區(qū)環(huán)境，組織相容性好，不引發(fā)移植排斥反應(yīng)

2、。目前可用于骨組織工程的種子細(xì)胞主要包括：成骨細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。其中成骨細(xì)胞是成體終末細(xì)胞，增殖潛能有限，來源困難。胚胎干細(xì)胞則受到倫理學(xué)的限制，成骨分化的調(diào)控機(jī)制也較為復(fù)雜。 實(shí)驗(yàn)方法： 1.采用Percoll密度梯度離心法從健康成人骨髓中分離人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；DMEM/F12+10％FBS常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞生長至80％-100％融合時(shí)以1:3傳代；FACS檢測(cè)第3代細(xì)胞的CD105、CD34表達(dá)。

3、 2.hTERT重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建和鑒定用質(zhì)粒提取試劑盒從DH5α大腸桿菌中分別提取pGRN145質(zhì)粒和pLXSN質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ酶切鑒定。 3.hTERT重組逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝和病毒滴度的測(cè)定，用質(zhì)粒提取試劑盒提取新構(gòu)建的pLXSN-hTERT重組質(zhì)粒，測(cè)定濃度，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染PT67細(xì)胞，應(yīng)用G418抗性，克隆環(huán)和有限稀釋法篩選陽性克隆。用3T3細(xì)胞按常規(guī)方法測(cè)定病毒滴度。選擇滴度最高的PT67細(xì)胞進(jìn)行下一

4、步實(shí)驗(yàn)。 4.hTERT重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染hMSCs細(xì)胞，將病毒滴度最高的hTERT-PT67克隆細(xì)胞用絲裂霉素處理，與第2代hMSCs共培養(yǎng)以感染hMSCs，應(yīng)用G418篩選出抗性細(xì)胞群hTERT-hMSCs。 5.免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)hTERT-hMSCs細(xì)胞中hTERT蛋白表達(dá)，以hMSCs為對(duì)照。 6.端粒酶活性檢測(cè)試劑盒(TRAPEZETelomeraseDetectionKit)檢測(cè)hTERT-hMS

5、Cs端粒酶活性，以hMSCs為對(duì)照。 7.CTLA4Ig重組腺病毒(Adv-CTLA4Ig-EGFP)直接感染hMSCs和hTERT-hMSCs。倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白(EGFP)的表達(dá)，流式細(xì)胞儀(FACS)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。 8.免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)CTLA4Ig-hMSCs和CTLA4Ig-hTERT-hMSCs細(xì)胞中CTLA4Ig蛋白表達(dá)。Westernblotting檢測(cè)CTLA4Ig-hMSCs和CTLA4I

6、g-hTERT-hMSCs細(xì)胞培養(yǎng)液中CTLA4Ig蛋白。 9.用倒置光學(xué)顯微鏡觀察hMSCs、CTLA4Ig-hMSCs、hTERT-hMSCs和CTLA4Ig-hTERT-hMSCs的形態(tài)及其生長情況。 10.FACS測(cè)定hMSCs、CTLA4Ig-hMSCs、hTERT-hMSCs和CTLA4Ig-hTERT-hMSCs的細(xì)胞周期。 11.用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含地塞米松、維生素C和β-GP的DMEM/F12)

7、進(jìn)行。CTLA4Ig-hMSCs和CTLA4Ig-hTERT-hMSCs的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)3周后進(jìn)行成骨特異性標(biāo)志檢測(cè)。 12.組織工程骨構(gòu)建：采用單向接種法將成骨誘導(dǎo)1周的CTLA4Ig-hMSCs和hMSCs接種到脫鈣骨基質(zhì)(DBM)上，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)1周后應(yīng)用，用前計(jì)算單位重量DBM所吸附的細(xì)胞數(shù)量。 13.CTLA4Ig-hMSCs和hMSCs細(xì)胞成骨動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：新西蘭大白兔20只，雌雄不限，體重2.5-3

8、.5千克，隨機(jī)分為4組，A組：DBM+CTLA4Ig-hMSCs，B組：DBM+hMSCs，C組：DBM，D組：空白。每組5只，采用兔橈骨缺損動(dòng)物模型進(jìn)行骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)。術(shù)后2天、2周、4周、8周、12周進(jìn)行X線攝片觀察骨缺損部位成骨修復(fù)情況。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.分離培養(yǎng)的原代hMSCs呈紡錘形或三角形，類似纖維細(xì)胞，旋渦樣排列；第3代細(xì)胞FACS檢測(cè)結(jié)果顯示：分離培養(yǎng)的細(xì)胞90.8％表達(dá)CD105表達(dá)，96.2％CD34

9、為陰性。證明該細(xì)胞為高純度的hMSCs。 2.pGRN145質(zhì)粒用EcoRⅠ單酶切獲得一條11.5Kb的載體片斷和一條3.5Kb的hTERT目的片斷；pLXSN質(zhì)粒EcoRⅠ單酶切獲得一條5.9Kb的線性片斷，將回收純化的hTERT和線形化pLXSNDNA片段經(jīng)過連接，轉(zhuǎn)化和酶切鑒定，獲得pLXSN-hTERT重組質(zhì)粒。 3.pLXSN-hTERT重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的PT67細(xì)胞經(jīng)過G418抗性篩選獲得產(chǎn)病毒hTERT-PT6

10、7包裝細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清(病毒液)病毒滴度為1.2×104。 4.pLXSN-hTERT-PT67包裝細(xì)胞與hMSCs共培養(yǎng)5天，G418抗性篩選30天。存活細(xì)胞命名為hTERT-hMSCs。細(xì)胞培養(yǎng)至第46代，細(xì)胞形態(tài)無明顯變化，生長良好。 5.hTERT-hMSCs和hMSCs細(xì)胞hTERT免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，兩種細(xì)胞hTERT蛋白陽性表達(dá)均在細(xì)胞核，hTERT-hMSCs細(xì)胞核全部深染，計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野

11、陽性率99％，hMSCs陽性率65％。 6.端粒酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，hMSCs細(xì)胞有50bp端粒酶活性產(chǎn)物條帶，但未形成6堿基梯度遞增條帶，hTERT-hMSCs細(xì)胞TRAP產(chǎn)物擴(kuò)增梯度遞增條帶：50bp、56bp、62bp、68bp、74bp等明顯可見。說明未經(jīng)轉(zhuǎn)染的hMSCs有低水平的端粒酶活性。經(jīng)hTERT基因轉(zhuǎn)染的hMSCs，即hTERT-hMSCs細(xì)胞端粒酶活性明顯增強(qiáng)。 7.CTLA4Ig重組腺病毒(AdvC

12、TLA4Ig-EGFP)感染hMSCs后48小時(shí)，感染hTERT-hMSCs后24小時(shí)可見少量細(xì)胞表達(dá)綠色熒光，隨后逐漸增多，兩種細(xì)胞的綠色熒光蛋白表達(dá)高峰均在第5天，第28天綠色熒光開始減少。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，hMSCs感染率為81.14％，hTERT-hMSCs感染率為83.75％。 8.免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，大多數(shù)CTLA4Ig-hMSCs和CTLA4Ig-hTERT-hMSCs在胞漿中可見CTLA4-Ig蛋白陽性表達(dá)，

13、核周圍最明顯。 9.細(xì)胞形態(tài)觀察可見hMSCs、CTLA4Ig-hMSCs、hTERT-hMSCs和CTLA4Ig-hTERT-hMSCs均以長梭形細(xì)胞為主，有少量細(xì)胞呈三角形。隨著細(xì)胞的多次傳代，hMSCs逐漸變寬變短，生長變慢。而hTERT-hMSCs保持長梭形，突起增多，三角形和多角形的細(xì)胞稍增多。生長速度無明顯改變。 10.細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果1-12代hMSCsG0/G1逐漸增多G2/M和S期細(xì)胞逐漸減少，統(tǒng)計(jì)分析

14、相差顯著。說明細(xì)胞增殖能力逐漸減弱；1-18代hTERT-hMSCsG0/G1細(xì)胞雖然也顯示逐漸增多G2/M和S期細(xì)胞逐漸減少，但統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示無明顯差異，說明hTERT-hMSCs增殖能力沒有隨著傳代次數(shù)的增加而明顯減弱。 11.CTLA4Ig-hMSCs和CTLA4Ig-hTERT-hMSCs成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中，前2周細(xì)胞形態(tài)和生長速度無明顯改變；2周后細(xì)胞逐漸變寬變短，多角形細(xì)胞增多，細(xì)胞有聚集成團(tuán)的趨勢(shì)，第3-4周時(shí)大多數(shù)

15、細(xì)胞為多角形且聚集成團(tuán)。 12.本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的組織工程骨，每克DBM上吸附、生長的細(xì)胞約5×105個(gè)。 13.CTLA4Ig-hMSCs異種動(dòng)物移植DBM+CTLA4Ig-hMSCs組在術(shù)后2周、4周骨缺損處呈現(xiàn)低密度云霧影，8周時(shí)呈高密度影，與骨組織相似，12周可見完全骨化，髓腔再通。DBM+MSCs組前4周和DBM+CTLA4Ig-hMSCs組相似，但8周時(shí)缺損處密度明顯低于DBM+MSCs-C組，12周骨缺損仍未完全

16、愈合。DBM組早期有云霧狀影，隨后逐漸消失。DBM組和空白組在觀察全程骨缺損逐漸縮小，但在術(shù)后12周仍留有明顯的骨缺損。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了hTERT重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN-hTERT。 2.篩選獲得了能夠產(chǎn)生hTERT重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝細(xì)胞系hTERT-PT67。 3.逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的hTERT基因轉(zhuǎn)導(dǎo)hMSCs細(xì)胞(hTERT--hMSCs)，與hMSCs細(xì)胞相比，端粒酶活性明顯增強(qiáng)，

17、增殖能力提高，生命周期延長。 4.CTLA4Ig基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的hMSCs(CTLA4Ig-hMSCs)和hTERT與CTLA4Ig雙基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的hMSCs(CTLA4Ig-hTERT-hMSCs)均可表達(dá)和分泌CTLA4-Ig蛋白。表達(dá)持續(xù)時(shí)間在4周以上。 5.腺病毒介導(dǎo)的CTLA4Ig基因轉(zhuǎn)染hMSCs和hTERT-hMSCs可使細(xì)胞群體倍增時(shí)間延長，生長速度變慢。 6.CTLA4Ig-hMSCs和CTLA4Ig-h