CTLA4Ig基因修飾人肝細胞株L02誘導免疫耐受的實驗研究.pdf

1、肝細胞移植是治療肝衰竭和代謝性肝病的重要手段之一,相對于肝臟移植,肝細胞移植具有來源較廣、費用相對低廉、創(chuàng)傷較小等優(yōu)點,可提供暫時性肝功能支持,為肝臟重建創(chuàng)造機會。但同肝移植一樣,排斥反應影響移植肝細胞的長期存活和遠期療效。目前解決排斥反應的主要策略是使用免疫抑制劑,但此類藥物毒副作用較大,需長期甚至終身使用,且增加感染和腫瘤的發(fā)生率。在此背景下,誘導移植物免疫耐受成為研究熱點。
　　 細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4免疫球蛋白(c

2、ytotoxic T-lymphocyte associatedantigen4-immunoglobulin,CTLA4Ig)是CTLA4分子胞外功能區(qū)與免疫球蛋白IgG恒定區(qū)相結(jié)合的融合性可溶性蛋白,可與T淋巴細胞表面的CD28分子競爭性結(jié)合抗原遞呈細胞(antigen presenting cell,APC)表面的B7分子,阻斷T細胞活化的共刺激通路,抑制T細胞活化,誘導對特異性抗原的免疫耐受。大量實驗已經(jīng)證實CTLA4Ig可以有

3、效抑制排斥反應,延長移植物存活時間,肝細胞移植中應用CTLA4Ig同樣被證實可有效誘導免疫耐受。其主要應用方法為CTLA4Ig蛋白的全身應用或各種載體介導CTLA4Ig基因的全身轉(zhuǎn)染。但此類方法同全身使用環(huán)孢霉素等傳統(tǒng)免疫抑制劑一樣,可能干擾機體整體免疫功能并導致非特異性免疫抑制。在此背景下,本研究利用重組腺病毒載體攜帶CTLA4Ig基因,在體外轉(zhuǎn)染正常人肝細胞株L02,使L02細胞表達具有免疫抑制生物學活性的CTLA4Ig,以期建立一

4、種通過移植肝細胞自身表達CTLA4Ig誘導免疫耐受的方法。實驗方法和結(jié)果如下:
　　 一、腺病毒介導CTLA4Ig基因轉(zhuǎn)染的L02細胞生物學特性的研究
　　 以重組人CTLA4Ig腺病毒載體(Ad-CTLA4Ig-EGFP)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的正常人肝細胞株L02,觀察轉(zhuǎn)染效率、轉(zhuǎn)染后L02細胞對CTLA4Ig的表達以及自身生物學特性的變化。結(jié)果顯示:
　　 1.自轉(zhuǎn)染后6小時開始L02細胞內(nèi)可見綠色熒光表達,48-7

5、2小時熒光強度達峰值,可持續(xù)較強表達2周,隨后逐漸衰減,28天時尚余微弱熒光;經(jīng)流式細胞儀檢測,重復感染度MOI為600時,轉(zhuǎn)染效率約為88.0％;免疫細胞化學及Western Blotting檢測提示轉(zhuǎn)染后L02細胞胞漿內(nèi)有大量CTLA4Ig表達,且可分泌至細胞外。ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)法檢測轉(zhuǎn)染后1周時上清中CTLA4Ig濃度達峰值,約為(16.55±1.20)ng/ml。<

6、br>　　 2.經(jīng)繪制細胞生長曲線,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后初期細胞生長速度稍減慢,但無統(tǒng)計學意義;經(jīng)檢測培養(yǎng)上清中尿素含量,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后L02細胞合成分泌尿素的能力較轉(zhuǎn)染前明顯升高(P＜0.01)。
　　 二、CTLA4Ig基因修飾的L02細胞(CTLA4-L02)體外、體內(nèi)誘導免疫耐受的研究
　　 1.CTLA4-L02與SD大鼠淋巴細胞混合培養(yǎng)后,以MTT法檢測淋巴細胞增殖,發(fā)現(xiàn)增值率明顯受到抑制(P＜0.05),抑制率約為36

7、.8％;經(jīng)CTLA4-L02抑制后的大鼠脾臟細胞再接受正常L02細胞刺激時僅發(fā)生輕度增殖,增值率明顯低于接受Hela細胞刺激的脾細胞(P＜0.01)。
　　 2.將CTLA4-L02經(jīng)脾臟注射移植給行2/3肝葉切除術(shù)的SD大鼠,術(shù)后第3、4周檢測鼠肝組織可見表達人白蛋白陽性的細胞存活,而注射生理鹽水及正常L02細胞的對照組為陰性;檢測術(shù)后1周的大鼠外周血發(fā)現(xiàn):1)轉(zhuǎn)染組大鼠(注射CTLA4-L02)外周血CD4+T細胞比例及激活

8、的CD4+T細胞(CD4+CD69+T細胞)比例均較未轉(zhuǎn)染組(注射L02細胞)降低(P＜0.01);2)轉(zhuǎn)染組大鼠外周血IL-2水平較未轉(zhuǎn)染組低(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1.腺病毒載體可介導CTLA4Ig基因高效率轉(zhuǎn)染人肝細胞株L02,轉(zhuǎn)染后的L02細胞可在胞漿內(nèi)有效表達CTLA4Ig蛋白并分泌至細胞外,表達持續(xù)時間超過4周;而自身生物學特性并未受到明顯負面影響。
　　 2.轉(zhuǎn)染后的L02細胞在體外