經(jīng)sTNFRi-IgGFc基因修飾的樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)大鼠肺移植術(shù)后免疫耐受的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 1、在“三套管”法的基礎(chǔ)上，建立大鼠左肺原位移植的最佳模型，為進(jìn)一步研究誘導(dǎo)大鼠肺移植術(shù)后免疫耐受狀態(tài)提供動物模型。
　　 2、建立大鼠骨髓源性樹突狀細(xì)胞(DC)的體外培養(yǎng)和擴(kuò)增方法，并通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染質(zhì)粒sTNFRI-IgGFc基因，觀察、測定DC細(xì)胞的生物學(xué)特性。
　　 3、探討sTNFRI-IgGFc基因修飾的樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)大鼠肺移植術(shù)后免疫耐受的可能機(jī)制。
　　 方法：
　　

2、1、外科顯微放大鏡下采用“三套管法”完成大鼠同種異體左肺原位移植模型，通過手術(shù)成功率、手術(shù)時間、病理學(xué)改變等指標(biāo)評估模型的可行性。
　　 2、利用重組大鼠粒細(xì)胞．巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rrGM-CSF)和重組大鼠白細(xì)胞介素-4（rrIL-4）誘導(dǎo)Wistar大鼠骨髓細(xì)胞分化成為DC細(xì)胞，于培養(yǎng)第5天收集細(xì)胞分組，并行脂質(zhì)體介導(dǎo)的質(zhì)粒sTNFRI-IgGFc基因轉(zhuǎn)染，第7d加入LPS刺激。第9天行DC細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定和功能測定。包括

3、形態(tài)觀察、細(xì)胞免疫表型的流式細(xì)胞儀鑒定，通過制備負(fù)載供體抗原的受體DC細(xì)胞與受體脾臟T細(xì)胞性單向淋巴細(xì)胞反應(yīng)，觀察各組刺激T細(xì)胞增殖情況；最后采用酶聯(lián)吸附試驗(yàn)(ELISA)測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子水平（sTNFRI、IL-12，TNF-α）的含量。
　　 3、將SD大鼠做為供體、Wistar大鼠做為受體。分為對照組、imDC組、sTNFRIIgGFc-DC組，每組20只大鼠，行10例左肺原位移植。每組分別注射100ulPBS、

4、imDC（數(shù)量為1×106，懸于100ulPBS中）、100ulsTNFRIgGFc-DC
　　 （數(shù)量為1×106，懸于100ulPBS中），于術(shù)前7天、術(shù)前、術(shù)后7天共3次靜脈注射。每組隨機(jī)取5只大鼠于移植后第7天處死，做相關(guān)檢測，包括受鼠脾臟T細(xì)胞的單向淋巴細(xì)胞反應(yīng)、血清細(xì)胞因子(IL-2、IL-4、IL-10、INF-γ、TNF-α)水平，剩余5只觀察存活情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、完成大鼠左肺原位移

5、植正式實(shí)驗(yàn)25例，20例存活,5例死亡，成功率80％。供肺灌洗到獲取完成時間（10±1）min，體外套管時間(10±1)min，供受體動靜脈和支氣管吻合時間(40±2)min。對移植肺(n=5)行夾閉實(shí)驗(yàn)，阻斷右側(cè)肺門，單肺通氣維持20min，大鼠心跳呼吸平穩(wěn)。受鼠于術(shù)后7天內(nèi)均存活
　　 2、所獲得的DC細(xì)胞在光鏡和電鏡下均表現(xiàn)為DC的典型形態(tài)，流式細(xì)胞儀表型檢測也為典型DC的特征。sTNFRIIgGFc-DC在細(xì)胞表型和ML

6、R、細(xì)胞因子分泌上具有不成熟DC的特征：能分泌大量的sTNFRI，還能拮抗LPS的促熟作用。
　　 3、sTNFRllgGFc-DC組刺激T細(xì)胞增殖能力弱于對照組和imDC組(p＜0.05)，而IL-4、IL-10水平明顯高于對照組和imDC組(p＜0.05)，IL-2、IFN-γ水平低于前兩組(p＜0.05);TNF-α含量基因轉(zhuǎn)染組明顯低于前兩組(p＜0.05)。在病理切片上，也可見sTNFRIIgGFc-DC組炎癥反應(yīng)輕。

7、
　　 結(jié)論：
　　 1、通過“三套管”法建立了穩(wěn)定的大鼠左肺原位移植模型
　　 2、成功建立了大鼠骨髓源性DC細(xì)胞的體外培養(yǎng)和擴(kuò)增，并通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染質(zhì)粒sTNFRI-IgGFc基因，制備了具有抗LPS成熟和高表達(dá)sTNFRI-IgGFc基因的能“致耐受”的DC細(xì)胞。
　　 3、sTNFRI-IgGFc基因修飾的樹突狀細(xì)胞能夠誘導(dǎo)大鼠肺移植術(shù)后免疫耐受，延長移植物存活?？赡艿臋C(jī)制為sTNFRI-IgGFc