雷帕霉素聯(lián)合供體未成熟樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)大鼠肝移植免疫耐受.pdf

1、器官移植已成為挽救終末期器官功能衰竭病人生命的有效途徑。外科技術(shù)和免疫抑制治療的進(jìn)步已經(jīng)很大地改善了器官移植病人的短期存活率。然而，目前的免疫抑制劑有多種副作用，而如何改善移植病人的長(zhǎng)期生存率和生活質(zhì)量已成為當(dāng)前器官移植領(lǐng)域的重要課題。解決這些問(wèn)題的最終途徑就是誘導(dǎo)免疫耐受。 樹突狀細(xì)胞(dendriticcells，DC)作為機(jī)體惟一能激活初始型T細(xì)胞(naiveTcells)的專職抗原提呈細(xì)胞(antigen—present

2、ingcells，APC)，在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答和免疫耐受中都起重要作用。目前，對(duì)DC免疫學(xué)功能的研究已取得了較大進(jìn)展：①未成熟DC(immatureDC，iDC)和成熟DC(matureDC，mDC)都能夠擁有致耐受特性。②DC的致耐受特性都與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatoryTcells，Treg)有關(guān)。DC誘導(dǎo)免疫耐受的機(jī)制包括誘導(dǎo)T細(xì)胞無(wú)能、刪除反應(yīng)性T細(xì)胞，或促進(jìn)Treg增殖。最近的研究更支持Treg的作用。Treg被認(rèn)為在致耐受D

3、C細(xì)胞下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。③DC俘獲和交叉提呈外源性抗原的獨(dú)特功能在無(wú)炎癥環(huán)境下能誘導(dǎo)抗原特異性免疫耐受。 雷帕霉素(Rapamycin，RAPA，又名sirolimus)作為一種大環(huán)內(nèi)酯類的新型免疫抑制劑，已被廣泛應(yīng)用于臨床抗排斥治療。研究表明，RAPA不僅能影響T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的功能，也能直接抑制DC發(fā)育成熟和誘導(dǎo)DC凋亡，RAPA還能增加體內(nèi)Treg來(lái)誘導(dǎo)免疫耐受。 本文通過(guò)體外培養(yǎng)大鼠髓源性DC，分析

4、了雷帕霉素對(duì)未成熟DC和已成熟DC表型和細(xì)胞存活影響的差異，觀察雷帕霉素處理后不同成熟狀態(tài)DC分泌細(xì)胞因子水平及介導(dǎo)同種混合淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的變化。建立大鼠同種異體原位肝移植模型，通過(guò)供體髓源性未成熟DC回輸受體大鼠聯(lián)合術(shù)后短期應(yīng)用雷帕霉素，觀察受體大鼠的生存時(shí)間，以及外周血和脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的增殖情況，探討雷帕霉素聯(lián)合未成熟DC誘導(dǎo)移植免疫耐受的可能機(jī)制。 第一部分雷帕霉素對(duì)大鼠髓源性樹突狀細(xì)胞表

5、型和功能的影響 DC在成熟過(guò)程中表型特征和功能均發(fā)生很大變化。未成熟DC顯示出較強(qiáng)的致耐受特性，但成熟DC在某些環(huán)境下也具有免疫調(diào)節(jié)能力。有研究表明，雷帕霉素能直接抑制DC抗原提呈功能、細(xì)胞遷移和發(fā)育成熟并誘導(dǎo)DC凋亡。為了進(jìn)一步明確RAPA對(duì)DC功能的影響及其機(jī)制，我們研究了RAPA處理不同成熟狀態(tài)大鼠髓源性DC的細(xì)胞表型變化、凋亡情況、細(xì)胞因子分泌以及刺激同種異基因T淋巴細(xì)胞增殖能力的變化，并從分子生物學(xué)角度初步探討了RAP

6、A對(duì)維持DC自身生存和發(fā)揮免疫學(xué)功能的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。 我們使用重組大鼠粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rrGM—CSF，終濃度為20ng/ml)和重組大鼠白細(xì)胞介素—4(rrIL—4，終濃度為10ng/ml)成功地體外培養(yǎng)出大鼠髓源性DC，大鼠DC特異性細(xì)胞表面標(biāo)志物OX62陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)大于85％。在培養(yǎng)第6d加入脂多糖(LPS)的同時(shí)加入RAPA(1～100ng/ml)，2d后流式細(xì)胞儀(FACS)檢測(cè)結(jié)果顯示OX6(M

7、HCⅡ類分子)和共刺激分子CD40和CD86的上調(diào)顯著受抑，細(xì)胞凋亡增加。 因成熟DC在特殊環(huán)境下也可擁有致耐受特性，我們研究了RAPA對(duì)LPS刺激48h后成熟DC的影響。發(fā)現(xiàn)RAPA對(duì)已完全成熟的DC表型影響較小，已成熟的DC能抵抗臨床相關(guān)劑量RAPA(1～20ng/ml)的促凋亡作用。凝膠遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)結(jié)果顯示，LPS刺激后的成熟DC細(xì)胞核內(nèi)NF—κB被強(qiáng)烈激活，RAPA不改變已成熟DC中NF—κB的DNA結(jié)合能力。

8、因此，成熟DC對(duì)RAPA誘導(dǎo)凋亡的抵抗作用可能與NF—κB的活化有關(guān)。 我們進(jìn)一步研究了RAPA對(duì)DC分泌細(xì)胞因子的影響。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)結(jié)果顯示iDC在LPS作用下，IL-10和IL-12的分泌顯著增加。但同時(shí)加入RAPA后，IL-10和IL-12的分泌水平均降低。而且和其低的細(xì)胞因子水平相一致，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)中，這種RAPA處理后的iDC激活同種異基因T細(xì)胞的能力降低。第8d的mDC加入RAPA培養(yǎng)

9、24h以后，IL-10和TNF—α分泌減少，但I(xiàn)L-12卻不再受抑制。Real—timePCR結(jié)果顯示，IL-12p35mRNA水平?jīng)]有變化，但I(xiàn)L-12p40mRNA的表達(dá)稍有上升。RAPA處理后的mDC具有不同的細(xì)胞因子表達(dá)水平說(shuō)明了這種成熟DC細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)生了改變。這種IL-12/IL-10的平衡向IL-12傾斜可能促進(jìn)Th1反應(yīng)并激發(fā)免疫應(yīng)答，但我們的研究發(fā)現(xiàn)這種RAPA處理后的成熟DC同樣具有低的刺激同種異基因T細(xì)胞增

10、殖的能力。MLR中T淋巴細(xì)胞分泌Th1型細(xì)胞因子IFN—γ和Th2型細(xì)胞因子IL—4均降低。RAPA處理的DC抑制效應(yīng)性T細(xì)胞增殖的同時(shí)，允許Treg細(xì)胞的活化和增殖可能解釋其抑制性的同種異基因T細(xì)胞增殖作用。通過(guò)調(diào)節(jié)DC功能來(lái)誘導(dǎo)或維持免疫耐受作用在某些環(huán)境下要求受者體內(nèi)DC的成熟和存活，同種異基因T細(xì)胞對(duì)RAPA處理后的成熟DC的低反應(yīng)性可能為移植免疫耐受的誘導(dǎo)提供新的思路。 第二部分大鼠同種異體原位肝移植模型的建立與改進(jìn)

11、 大鼠肝移植模型是進(jìn)行移植免疫學(xué)研究的理想動(dòng)物模型。我們?cè)凇岸涮追ā钡幕A(chǔ)對(duì)大鼠肝移植模型進(jìn)行了改良。以近交系雄性Lewis(LEW)大鼠和雄性BrownNorway(BN)大鼠為供受體，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為3組：①對(duì)照組(n=12)：正常LEW大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)照；②同基因組(n=12)：LEW→LEW大鼠；③急性排斥組(n=12)：LEW→BN大鼠。肝上下腔靜脈后壁的吻合采用供體腔靜脈壁與受體膈肌環(huán)吻合，前壁采用腔靜脈壁對(duì)腔靜脈壁吻合

12、。各組術(shù)后14d和28d分別處死3只，觀察術(shù)后大鼠肝功能、移植肝組織病理學(xué)變化。每組留6只觀察生存時(shí)間。結(jié)果顯示，手術(shù)成功率大于85％。急性排斥組術(shù)后出現(xiàn)ALT和BIL急劇上升，Banff評(píng)分Ⅲ級(jí)，大鼠中位存活時(shí)間為32d。而同基因組ALT和BIL經(jīng)術(shù)后短期上升后14d時(shí)即出現(xiàn)下降，Banff評(píng)分0～1級(jí)，大鼠能長(zhǎng)期存活。說(shuō)明改良“二袖套法”LEW→BN大鼠肝移植模型是穩(wěn)定的急性排斥反應(yīng)模型，可用于研究肝移植排斥反應(yīng)和免疫耐受。

13、 第三部分雷帕霉素聯(lián)合未成熟樹突狀細(xì)胞促進(jìn)CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)大鼠肝移植免疫耐受 CD4+CD25+Treg在對(duì)自身抗原和移植物的免疫耐受中發(fā)揮重要作用。體外實(shí)驗(yàn)表明雷帕霉素能促進(jìn)小鼠和人Treg增殖。RAPA處理的負(fù)載供者抗原的受體源性DC聯(lián)合短期應(yīng)用RAPA能使小鼠心臟移植物長(zhǎng)期存活。但RAPA聯(lián)合iDC是否能提高體內(nèi)Treg水平尚未闡明。我們研究了供者源性iDC聯(lián)合移植術(shù)后短期使用RAPA后受體大

14、鼠外周血和脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg的水平以及是否能誘導(dǎo)大鼠肝移植免疫耐受。 首先，我們研究了RAPA聯(lián)合iDC誘導(dǎo)同種異基因大鼠產(chǎn)生Treg的情況。FACS結(jié)果顯示，正常大鼠外周血和脾臟中CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T細(xì)胞的比例在6％～8％之間，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。單用RAPA腹腔注射7天或一次性靜脈注射2×106數(shù)量的iDC并不增加CD4+CD25+Foxp3+Treg在CD4+T細(xì)胞中的比例

15、。而聯(lián)合使用RAPA和iDC后，CD4+CD25+Foxp3+Treg在外周血和脾臟CD4+T細(xì)胞中的比例增加(分別為9.31±0.54％和9.38±0.89％)。CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞占CD4+CD25+T細(xì)胞的比例也增加。 由于聯(lián)合使用供者源性未成熟DC和移植后短期應(yīng)用RAPA對(duì)受體T細(xì)胞增殖的影響以及這種方案是否能誘導(dǎo)免疫耐受均未被闡明，我們建立了Lewis→BN大鼠肝移植模型。大鼠分四組：①急性排斥組(n＝

16、12)：術(shù)后連續(xù)7天腹腔注射生理鹽水1ml；②RAPA組(n=12)：術(shù)后連續(xù)7天腹腔注射RAPA1mg/kg/day(day0～day6)；③未成熟DC組(iDC，n＝12)：術(shù)前3天(day—3)單次尾靜脈注射LEW大鼠髓源性培養(yǎng)第6天的未成熟DC(2×106)；④RAPA+iDC組(n=12)：術(shù)前3天單次尾靜脈注射LEW大鼠髓源性培養(yǎng)第6天的未成熟DC(2×106)，術(shù)后連續(xù)7天腹腔注射RAPA1mg/kg/day。術(shù)后14、2

17、8d隨機(jī)處死3只，測(cè)定肝功能、血清IL—2和IL-12，以及外周血和脾臟CD4+CD25+Foxp3+Treg比例。每組各留6例觀察生存期。 結(jié)論：雷帕霉素對(duì)未成熟DC和已成熟DC刺激同種異基因T淋巴細(xì)胞增殖的能力都具有抑制作用。輸注供體髓源性未成熟DC聯(lián)合術(shù)后短期使用雷帕霉素的方法能明顯促進(jìn)肝移植術(shù)后外周血和脾臟中CD4+CD25+Foxp3+Treg的增殖，減輕大鼠肝移植術(shù)后免疫損傷并誘導(dǎo)免疫耐受。這種新的治療策略可能成為誘