CCR7基因修飾未成熟樹突狀細胞誘導大鼠高危角膜移植免疫耐受的研究.pdf

1、目的：體外培養(yǎng)和誘導供體大鼠骨髓來源的未成熟樹突狀細胞（immature dendritic cell，imDC），使用趨化因子受體7(chemokine receptor7，CCR7)基因重組腺病毒體外轉染imDC，研究其對大鼠同種異體高危角膜移植免疫排斥反應的影響，探討其誘導免疫耐受的機制。
　　方法：通過聯(lián)合應用重組大鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony stimulat

2、ing factor，GM-CSF）和白細胞介素（Interleukin，IL）-4體外培養(yǎng)、誘導、擴增大量的imDC，通過細胞形態(tài)及表型對其加以鑒定；將攜帶大鼠CCR7基因的重組腺病毒通過增強離心法轉染imDC，對轉染后的imDC再次進行形態(tài)及表型鑒定，并通過細胞免疫熒光檢測CCR7的表達；以60只SD大鼠作為受體，30只Wistar大鼠作為供體，通過堿燒傷建立高危角膜移植模型；采用隨機數字表法將受體SD大鼠分為空白對照組、未修飾im

3、DC組（imDC組）、imDC+空載體腺病毒組(imDC+Ad組)和 imDC+CCR7腺病毒組(imDC+Ad-CCR7組)，每組各15只；各組受體術前7d和術后3d分別經尾靜脈注入PBS液、供體來源的未修飾imDC、空載體腺病毒轉染后的imDC和攜帶CCR7基因的腺病毒轉染后的imDC(1×107個/只，細胞懸浮于0.1ml PBS液中，空白對照組只注入等量PBS液)；術后每日在裂隙燈下觀察角膜植片的存活情況并評分，術后14d每組隨

4、機處死6只受體大鼠，取角膜植片行HE切片觀察以及通過RT-PCR檢測Th1型細胞因子IL-2、干擾素-γ（interferonγ，IFN-γ）和Th2型細胞因子IL-4、IL-10的mRNA表達水平。
　　結果：培養(yǎng)的imDC經過倒置相差顯微鏡及掃描電鏡的形態(tài)學觀察、流式細胞儀進行的免疫學表型檢測，可證實為實驗所需的imDC；細胞免疫熒光顯示imDC不表達CCR7，imDC經空載體腺病毒轉染后不表達CCR7,經CCR7腺病毒轉染后

5、CCR7表達增加；角膜移植術后，imDC+Ad-CCR7組大鼠角膜植片的混濁、水腫及新生血管程度評分較其他組均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；角膜植片平均存活時間（MST）：imDC+Ad-CCR7組較對照組、imDC組和imDC+Ad組顯著延長，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；角膜HE切片顯示，imDC+Ad-CCR7組植片輕度水腫、基質層板層纖維排列有序，imDC組和imDC+Ad組呈不同程度水腫，基質層板層纖維排列輕

6、度紊亂、有少量的炎性細胞；空白對照組的植片高度水腫、角膜基質板層纖維紊亂，出現(xiàn)大量炎性細胞和新生血管；RT-PCR顯示：imDC+Ad-CCR7組Th1型細胞因子IFN-γ、IL-2 mRNA的表達較對照組、imDC組和imDC+Ad組明顯降低；Th2型細胞因子IL-4、IL-10 mRNA的表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（均為P<0.05）。
　　結論：通過腺病毒增強離心法轉染imDC可使CCR7基因有效轉入imDC并表達CCR