CCR7聯(lián)合Rel-B基因對小鼠未成熟樹突細胞免疫原性和遷移功能的影響.pdf

1、研究背景及研究目的：
　　燒傷是平時生活和戰(zhàn)爭中比較常見的疾病,淺度燒傷可以經過藥物治療后自愈,然而治愈深度燒傷最好的辦法是皮膚移植?，F(xiàn)在治愈大面積深度燒傷中皮膚移植是常用的方法,皮膚移植往往是自體皮膚移植,但自體皮膚移植往往存在的一個缺點就是自身可供移植的皮膚不夠,不能完全覆蓋創(chuàng)面,影響到治療效果?？茖W家們曾經嘗試用過同種異體皮膚移植來解決皮膚移植中供皮來源不足的問題,但同種異體皮膚往往伴激活免疫應答,免疫應答和免疫排斥導致皮膚

2、移植的失敗,為了解決這個問題,科學家們一直探索免疫耐受的機制,包括免疫細胞的特性,特別是抗原提呈細胞(APC)和調節(jié)性T細胞(Treg)。樹突狀細胞(DC)是一種功能強大的抗原提呈細胞,DC能夠攜帶抗原信息,從外周器官遷移到淋巴組織的T淋巴細胞區(qū),將抗原提呈給T淋巴細胞,激活活化初始T淋巴細。同時,DC可以通過誘導形成調節(jié)性T淋巴細胞,細胞克隆刪除和刪除記憶性T細胞,在形成免疫耐受和免疫排斥中起著重要作用[1,2]。這就使DC作為一種治

3、療方法在移植中探索應用。在動物實驗中,輸入捐助者或接收者來源的耐受性DC,可以更廣泛地延長移植物的存活。在臨床實驗中,DC在移植中也開始應用,但仍存在很多問題需要解決,包括細胞的分離和純化技術,細胞的來源和途徑,以及如何靶向性的誘導免疫耐受等[3]。
　　未成熟樹突狀細胞(immature dendritic cell,imDC)有著較高的抗原遞呈能力以及較低的共刺激分子,能夠誘導低免疫應答和產生免疫耐受,所以imDC成為了現(xiàn)在誘

4、導免疫耐受研究的重點,這已經在我們以前國家自然科學基金項目(No.30271341)中得到證明。而我們在國家自然科學基金項目(No.30672173)也證實imDC轉染CCR7后具有較高的遷移能力,將轉染CCR7基因的imDC輸入同種異體皮膚移植小鼠中后,其皮膚存活時間明顯長于輸入mDC組以及輸入PBS組。因為imDC能夠誘導免疫耐受,但具有較低的CCR7,所以在國家自然科學基金項目(No.30672173)中,我們試圖通過腺病毒轉染C

5、CR7基因使供者源imDC的CCR7表達上升,增強imDCs的遷移及免疫耐受能力,但腺病毒轉染imDC也會部分促使imDC向mDC分化,使共刺激分子升高,共刺激分子通過與相應受體結合,可為T細胞激活提供第二信號,再通過引發(fā)T細胞分化和相關細胞因子分泌等,對機體免疫起著正性作用,影響了誘導免疫耐受功能的發(fā)揮。如何使CCR7基因轉染imDC后能夠上升CCR7基因表達同時抑制共刺激分子的表達呢?現(xiàn)在研究發(fā)現(xiàn),RelB基因能夠調節(jié)共刺激分子的表

6、達,下調RelB基因,能夠下調共刺激分子。為更好的發(fā)揮供者源imDC的作用,我們嘗試同時轉染上調CCR7基因和下調RelB基因,使imDC有著較高遷移性的同時表達較低共刺激分子,更好的誘導形成免疫耐受,從而為延長同種異體皮膚的存活時間提供一個新的思路和方法。
　　研究方法：
　　1、小鼠骨髓來源樹突狀細胞的形態(tài)及功能鑒定
　　在體外,GM-CSF和IL-4聯(lián)合培養(yǎng)誘導小鼠骨髓來源的單核細胞成為樹突狀細胞,第5天的細胞為

7、imDC,而在7天時加入LPS刺激,形成mDC,通過光鏡、電鏡來觀察細胞形態(tài)。流式細胞儀和蛋白電泳檢測特異性標志分子和共刺激分子的表達?；旌狭馨图毎磻虴LISA實驗檢測imDC和mDC功能的變化。
　　2、小鼠趨化因子CCR7重組慢病毒感染對DC2.4細胞免疫原性和遷移功能的影響
　　分別構建空載慢病毒和帶有CCR7上升基因的慢病毒,并且?guī)в芯G色熒光蛋白,培養(yǎng)小鼠未成熟細胞細胞系DC2.4,用慢病毒感染DC2.4,分為三

8、組,正常DC2.4組叫做DC2.4組,空載慢病毒感染DC2.4組叫做GFP-DC2.4,帶有CCR7上升基因慢病毒感染DC2,4組,叫做CCR7-DC2.4。光鏡和熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài),流式細胞儀,蛋白印跡法分別檢測感染前后共刺激分子CD80和CD86的變化,激光共聚焦檢測CCR7分子的變化,體外趨化實驗檢測體外趨化能力的改變。
　　3、上調小鼠CCR7聯(lián)合下調Rel-B基因對未成熟樹突細胞免疫原性和遷移功能的影響
　　

9、設計RelBSiRNA,用CCR7腺病毒和Rel-BSiRNA同時轉染imDC,用光學顯微鏡和熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)和轉染效率,用流式細胞儀檢測CCR7的變化,趨化實驗檢測遷移功能的變化。加入LPS刺激使imDC變?yōu)閙DC,蛋白電泳檢測Rel-B的蛋白表達變化,流式細胞儀檢測共刺激分子CD80和CD86的變化,混合淋巴細胞反應檢測免疫原性的變化。
　　實驗結果：
　　1、小鼠骨髓來源樹突狀細胞的形態(tài)及功能鑒定
　　1.

10、1、小鼠骨髓源樹突狀細胞體外培養(yǎng)光鏡觀察情況
　　培養(yǎng)的第3天可見有樹突狀突起的細胞,形態(tài)上體積比較小,比較圓潤,疏松貼壁并聚集成團呈集落樣生長。至第5天突起逐漸增多,細胞團也逐漸增多,細胞體積增大,表面毛刺狀突起明顯,但仍然疏松貼壁生長,加入LPS刺激后可見細胞表面伸出比較明顯的樹突狀樣結構,長短大小不一,懸浮細胞數(shù)目增多和體積增大,突起明顯增多增大。
　　1.2、小鼠骨髓來源樹突狀細胞掃描電鏡觀察結果
　　從掃描電

11、鏡結果可見:imDC表面較光滑,但表面凹凸不平,毛刺狀突起幾乎沒有。mDC表面不光滑,并且伸出許多樹枝樣突起,長短不一,形態(tài)各異,比較符合成熟DCs的典型細胞形態(tài),為下一步功能實驗奠定了基礎。
　　1.3、小鼠骨髓源樹突細胞按照上述方法分離,經IL-4、GM-CSF作用后,于第5天加入LPS刺激其向成熟轉變,流式細胞術檢測細胞表面分子CD11C,CD80,CD86,MHCⅡ的表達。在imDC中CD11c、CD80、CD86、MHC

12、Ⅱ的陽性率分別低于在mDC的表達率,統(tǒng)計學顯示,imDC和mDC的CD11C、CD80、CD86、MHCⅡ差異均有統(tǒng)計學意義(p<0.01),這符合imDC低表達而mDC高表達表面分子的表型特征。
　　1.4、從蛋白電泳圖上可以看出,成熟樹突細胞的CD80、CD86表達明顯高于未成熟樹突細胞的蛋白表達。imDC的CD80蛋白表達量為(0.65±0.1),而mDC的蛋白表達量為(1.36±0.1),為imDC的2倍,存在明顯差異(P

13、<0.01)。imDC的CD80蛋白表達量為(0.54±0.1),而mDC的蛋白表達量為(1.47±0.08),為imDC的2.7倍,存在明顯差異(P<0.01)。說明imDC受到刺激后,共刺激分子CD80和CD86會明顯上升,為以后的進一步實驗奠定基礎。
　　1.5、通過單向混合淋巴細胞反應(MLR)來評價培養(yǎng)的imDC對同種異體未致敏T淋巴細胞的刺激能力,imDC刺激T細胞后OD值為:(1.33±0.31),mDC刺激T細胞后

14、OD值為:(2.38±0.4),對T細胞的刺激能力是imDC的1.79倍,存在明顯差異(P<0.01)。
　　1.6、通過ELISA結果顯示,imDC分泌IL-2和IFN-γ量分別為(2848.37±162.67)pg/ml和(156.25±27.09)pg/ml,mDC分泌IL-2和IFN-γ量分別為(3610.36±106.59)pg/ml和(287.33±14.85)pg/ml,成熟樹突細胞分泌IL-2和IFN-γ量明顯高于

15、未成熟樹突細胞(P<0.01)。imDC分泌IL-4和IL-10量分別為:(186.56±6.6)pg/ml和(147.40±23.23)pg/ml,mDC分泌IL-4和IL-10為(106.5±5.3)pg/ml和(77.91±10.88),imDC分泌IL-4量明顯高于mDC(p<0.01)。從以上結果可以看出,mDC刺激T細胞分泌的細胞因子IL-2和IFN-γ明顯高于imDC(p<0.01),而imDC刺激T細胞分泌的IL-10和

16、IL-4明顯高于mDC(p<0.01)。
　　2、小鼠趨化因子CCR7重組慢病毒感染對DC2.4細胞免疫原性和遷移功能的影響
　　2.1、光鏡下觀察DC2.4細胞呈貼壁生長,集落式生長,細胞形態(tài)呈圓形,慢病毒感染后細胞形態(tài)沒有明顯改變。24h后熒光顯微鏡下觀察,就可以發(fā)現(xiàn)明亮的GFP表達,此后逐漸增強,并且在96小時達到熒光強度達到高峰,陽性率可以達到87.4％。
　　2.2、經過流式上機檢測后,3組細胞CD80、CD

17、86、MHCⅡ的表達陽性率分別為無明顯差異。統(tǒng)計結果P值均大于0.05。
　　2.3、蛋白印記結果
　　蛋白印記結果顯示,CCR7-DC2.4組CCR7蛋白表達量(45.1±2.1)明顯高于DC2.4(25.32±1.4)和GFP-DC2.4(28.6±0.9)(P<0.01)。DC2.4、GFP-DC2.4和CCR7-DC2.4的CD80表達量分別為33.9±2.2、33.2±1.6、32.9±1.8,三組無明顯差別(P>

18、0.05)。DC2.4、GFP-DC2.4和CCR7-DC2.4的CD86表達量分別為39.9±1.3、33.1±2.1、33.9±2.3,三組無明顯變化(P>0.05)。
　　2.4、細胞免疫熒光結果
　　細胞免疫熒光顯示DC2.4細胞表達很低的CCR7,GFP-DC2.4細胞可表達少量CCR7,CCR7-DC2.4細胞CCR7的表達增加,說明慢病毒載有CCR7基因能夠有效的轉入DC2.4并表達CCR7蛋白。
　　2

19、.5、體外遷移實驗結果
　　體外遷移實驗表明,CCR7-DC2.4在CCL19作用下體外趨化遷移率(35.33±5.4)%明顯高于DC2.4(5.5±0.6)%和GFP-DC2.4(6.34±0.6)%(P<0.01)。說明載有CCR7的慢病毒轉染DC2.4后,使其遷移功能明顯上升。
　　3、上調CCR7聯(lián)合下調Rel-B基因對小鼠未成熟樹突細胞免疫原性和遷移功能的影響
　　3.1、培養(yǎng)的imDC和mDC形態(tài)同第一部分

20、描述,用熒光顯微鏡觀察,均能看到腺病毒感染的綠色熒光和SiRNA感染的紅色熒光。說明腺病毒和SiRNA能夠有效的轉染DC。
　　3.2、用LPS刺激后,提取蛋白,檢測Rel-B,從蛋白電泳結果中可以看出,共轉染CCR7腺病毒和RelBSiRNA的DC表達較低Rel-B蛋白,明顯低于mDC。
　　3.3、流式細胞儀結果顯示,在轉染后第一天,imDC在轉染CCR7腺病毒和RelB-SiRNA后,CCR7陽性率表達明顯上升,明顯高

21、于imDC組。在經過LPS刺激后。imDC在轉染CCR7腺病毒和RelB-SiRNA后即使經過LPS刺激,其共刺激分子CD80和CD86陽性率低于mDC(P<0.01),說明共轉染轉染CCR7腺病毒和RelB-SiRNA能夠在LPS刺激時仍然保持較低的共刺激分子表達。
　　3.4、體外趨化實驗結果
　　在共轉染后,用體外趨化實驗檢測各組細胞的遷移率,結果如下,imDC:(3.92+0.23)%,imDC+空Ad:(10.60

22、+0.83)%,imDC+空SiRNA:(9.13+0.42)%,imDC+空Ad+空SiRNA:(17.50+1.0)%,imDC+Ad-CCR7:(33.83+2.47)%,imDC+Rel-BsiRNA:(3.47+0.38)%,imDC+Ad-CCR7+Rel-BsiRNA:(32.35+1.59)%,mdc:(29.38+1.02)%imDC在共轉染CCR7腺病毒和RelB-SiRNA后其遷移效率明顯高于imDC(P<0.01