CCR7基因修飾的未成熟樹突狀細(xì)胞對異基因骨髓移植小鼠GVHD的影響.pdf

1、目的：構(gòu)建含有小鼠趨化因子受體-7(chemokine receptor-7，CCR7)的慢病毒表達(dá)載體并感染未成熟樹突狀細(xì)胞(immature dendritic cells，imDCs)，觀察其對imDCs的免疫表型，刺激T淋巴細(xì)胞增殖能力及趨化遷移能力的影響；并通過構(gòu)建移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)小鼠模型，觀察imDCs對異基因骨髓小鼠急性GVHD的影響。
　　 方法：1、

2、以小鼠胸腺總RNA為模板，RT-PCR擴(kuò)增出CCR7基因片段，亞克隆pCR-Blunt載體，酶切并DNA測序驗(yàn)證正確后，通過IRES連接GFP報(bào)告基因，并連接至慢病毒骨架載體Lv-Lac，建立雙順反子慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，命名為Lv-CCR7，酶切鑒定。采用陽離子脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒，包裝質(zhì)粒△NRF及包膜質(zhì)粒pVSVG，共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，根據(jù)報(bào)告基因GFP測定病毒滴度，轉(zhuǎn)染48h、72h、96h收集上清，獲得攜帶CCR7基因的重組慢病毒。

3、取C57BL/6小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞以含20ng/mL粒-巨細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)imDCs，并以病毒上清感染imDCs，加或不加細(xì)菌脂多糖(LPS)刺激使其成熟，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞免疫表型，MTT法檢測淋巴細(xì)胞增殖能力，趨化實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力。2、構(gòu)建異基因骨髓移植小鼠模型，將CCR7基因修飾的imDCs輸入異基因骨髓移植小鼠體內(nèi)，并設(shè)立對照組。實(shí)驗(yàn)分組如下：①A組：單純照射（TB

4、I組）；②B組：GVHD對照組；③C組：imDCs組；④D組：Lv-CCR7-imDCs組（CCR7-imDCs組）。觀察移植后各組小鼠GVHD臨床評分，存活時(shí)間，生存率，肝臟、小腸、皮膚組織病理學(xué)，異基因嵌合情況。
　　 結(jié)果：1．成功構(gòu)建重組質(zhì)粒Lv-CCR7，轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞12h后在熒光顯微鏡下觀察到EGFP表達(dá)，48h、72h和96h收集病毒上清，病毒滴度為108U/L以上，獲得攜帶CCR7基因的重組慢病毒。2．小鼠

5、骨髓單個(gè)核細(xì)胞在培養(yǎng)24h后大部分貼壁生長，僅見少量懸浮細(xì)胞，約4d左右出現(xiàn)半黏附細(xì)胞集落，集落逐漸增多、變大，5d時(shí)細(xì)胞表面出現(xiàn)長短不一毛刺樣突起，流式細(xì)胞術(shù)鑒定DCs低表達(dá)CD86、CD80分子，經(jīng)脂多糖(LPS)刺激后高表達(dá)CD86、CD80分子，顯示出成熟型DC(mDCs)的表型特征，流式細(xì)胞術(shù)檢測到慢病毒感染后約(63.33±5.87)％的imDCs表達(dá)CCR7，表達(dá)量高于mDCs，3．體外混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中CCR7基因修飾的

6、imDCs刺激淋巴細(xì)胞的增殖能力與imDCs相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而LPS刺激的mDCs顯示出很強(qiáng)的刺激淋巴細(xì)胞增殖能力，與imDCs相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。4．體外趨化遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CCR7感染的imDCs在CCL21作用下其遷移能力明顯強(qiáng)于imDCs(P＜0.01)和mDCs(P＜0.05)。5．A、B、C和D組受鼠平均生存時(shí)間為(8.0±0.7)d、(10.6±0.9)d、(12.8±1.1)d、(24

7、.3±1.6)d，B、C兩組小鼠生存時(shí)間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），D組小鼠生存時(shí)間較B、C組延長（P＜0.01）。受鼠移植后GVHD評分D組較B、C組降低（P＜0.05），B、C組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。B組病理顯示肝臟、小腸、皮膚重度GVHD表現(xiàn)，而D組僅有輕微GVHD表現(xiàn)。
　　 結(jié)論：1．成功構(gòu)建小鼠CCR7基因重組慢病毒載體，獲得了高滴度的重組慢病毒。2．經(jīng)含CCR7的慢病毒感染imDCs后，CCR7的