nk細(xì)胞在小鼠異基因骨髓移植中的作用

1、中國(guó) 病理生理雜志C h i n e s eJ o u r n a lo fP a t h o p h y s i o l 0o 41I2 ： !二[ 文章編號(hào)】 1 0 0 0 — 4 7 1 8 i 2 o o 4 ) o 9 — 1 5 6 3 一 o 5N K 細(xì)胞在 小 鼠異基 因骨 髓移植 中的作 用 *楊志剛，曾耀 英△ ，何賢輝 ，王 通，王 青 ( 暨南 大學(xué)組織移植與免疫教育部 重點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)室 ， 廣東 廣州 5 1

2、0 6 3 2 )【 摘 要]目的： 研究 自 然殺傷( N g ) 細(xì)胞在異基因骨髓移植 中對(duì)移植物抗宿主病( G V H D ) 、 移植排斥、 骨髓植 入及造血重建 的影 響。方法 ： 以近交 系小鼠 C 5 7 ／ 6 j ( H一2) 為供 鼠、 B A L B ／ c ( H一 2) 為受 鼠， 在 移植 物中增 加供 者 的外周 T細(xì)胞 和／ 或 N K細(xì)胞進(jìn)行異基 因骨髓移植 ， 用流 式細(xì)胞 儀 檢測(cè) 受 鼠的 C D

3、 3 4細(xì)胞計(jì) 數(shù)和 H一 2 K b細(xì)胞表 達(dá)水 平 ， 血細(xì)胞 自動(dòng)分析儀檢測(cè) 外周 血 白細(xì)胞計(jì)數(shù) ， 并結(jié)合臨床表 現(xiàn)和病 理檢查 ， 比較不 同移植 組 的存活率 、 G V H D 、 植入 水平及 造血重建等。結(jié)果 ： 增加 N K細(xì)胞組的小 鼠存活率 顯著大 于不增 加 N K細(xì)胞 組 ， 小 鼠出現(xiàn) G V H D的數(shù) 量少 、 程 度輕 ， 外周血 白細(xì)胞及骨髓 C細(xì)胞恢 復(fù)快 、 H一 2 K b細(xì)胞表 達(dá) 水平高

4、 。結(jié)論 ： N K細(xì)胞抑制小 鼠異基 因骨髓 移植 中的 G V I - I D和移植 排斥 ， 促進(jìn)骨髓 植入及造血重建 。[ 關(guān)鍵詞] 殺傷細(xì)胞， 天然； 異基因； 骨髓移植； 同種異基因反應(yīng)性 ； 移植物抗宿主病 [ 中圖分類號(hào)] R 3 9 2 ． 1 1[ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A自然 殺傷 ( n a t u r a lk i t i e r ， N K ) 細(xì) 胞 是 機(jī) 體 重要 的免疫 細(xì)胞 ， 在 對(duì) 抗 腫 瘤 和 病

5、毒 感 染 方 面 起 十 分 重 要 作 用 。最近 研 究 表 明 ， N K 細(xì) 胞 還 參 與 機(jī) 體 造 血 調(diào) 控 。在異 基 因骨髓 移植 中 ， N K細(xì)胞 可 能發(fā) 揮 促 進(jìn) 骨 髓植入及造血重建 、 減輕移植物抗宿主病 ( g r a f t — v e r ．S U S —h o s td i s e a s e ，G V H D) 并 增 強(qiáng) 抗 腫 瘤 效 應(yīng) 等 作 用u ． 2J 。但 目前對(duì) N K細(xì)胞

6、在 異基 因骨髓移植 中的 效應(yīng)及其機(jī)制尚未清楚。本實(shí)驗(yàn)在小 鼠異基 因骨髓 移植的移植物中增加一定數(shù)量的供鼠 N K細(xì)胞 ， 研究 N K細(xì) 胞對(duì) 異 基 因 骨髓 移 植 的影 響 ， 不 僅 為研 究 N K細(xì)胞 在異 基 因骨髓 移植 中 的效 應(yīng) 及 機(jī) 制 提供 了有 價(jià) 值 的實(shí) 驗(yàn) 資料 ， 而 且 對(duì) 異 基 因骨 髓 移 植 的 臨 床 應(yīng) 用 有一 定 的實(shí) 際意義 。材 料 和 方 法 1 主要試 劑 A n t

7、 i —mo u s eC D 4 5一 F T I E 、 CD 3 4 一 P E、 H 一2 Kb—P E 、 H一2 K一F 1 T C和 T mC o n t 購(gòu) 自 P h a r m i n g e n公 司 ，a n t i —n l o u s , eC D 3 一F 1 T C 、 N K】 】 一P E購(gòu) 自 B i o sc i e n c e 公 司 ， 重組 人 白細(xì)胞 介 素 一 2 ( r h m 一 2

8、 ) 購(gòu) 自北 京 四環(huán) 生 物 制藥 有 限公司 。R P M I 一1 6 4 0培養(yǎng) 液 和胎 牛血 清購(gòu) 自 G i b c o 公 司。2 受鼠 準(zhǔn)備 S P F 級(jí) B A L B ／ c 雌 性小 鼠 ， 8 一l 0 周 ， 體 重 約2 0g 。移植前 5d 開始飲用含慶大霉素( 3 ． 2 ×1 0 s U ／ L ) +紅 霉素( 2 5 0m g ／ L ) 的滅菌水 ， 移植前 4h予[ ∞ C o

9、y ]射 [ 收稿日期】 2 O O 4 — 0 4 — 1 9[ 修回日 期】 2 O O 4 — 0 6 — 2 2*[ 基金項(xiàng)目】國(guó)家“ 9 7 3 ” 重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃項(xiàng) 目( № G 2 0 0 ~5 7 0 0 6 ) ； 國(guó)家 自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng) 目( N o ． 3 9 9 3 0 2 3 0 )△通訊作者 ： T e l ： 0 2 0 —8 5 2 2 0 2 9 8 ；E—m a i l - ． o z m s

10、 @j n u ． e d u ． c a線 全 身 照 射 ( t o t a lb o d yi r r a d i a t i o n ， T B I ) ?？?劑 量 8 ． 5G y ， 劑 量 率 0 ． 5G y ／ m i n 。3 供 鼠骨 髓與 外周 T細(xì) 胞 的準(zhǔn) 備 8 —1 2 周 齡 的 清 潔 級(jí) C 5 7 ／ 6 j 雄 性 小 鼠 ， 斷 髓 處 死 ， 無(wú) 菌 分 離 股 骨 、 脛 骨 與 脾 臟

11、 。剪 去 骨 垢 端 ， 用 注射 器 沖 出骨髓 腔 內(nèi)細(xì) 胞 ， 裂 解 紅 細(xì) 胞 后 用 磷 酸 緩 沖液 ( p h o s p h a t e — b u f e r e ds a l i n e ， P B S ) 洗滌 2 次， 計(jì)數(shù)備 用 ； 脾臟于 2 0 0目 篩 網(wǎng)上研磨濾過(guò) 收集脾細(xì)胞 ， 用淋 巴細(xì)胞 分 離液 常 規(guī)分 離單 個(gè) 核細(xì) 胞 作 為 外 周 T細(xì) 胞 ( 經(jīng) 檢 測(cè) C細(xì)胞 占 6 0 ％

12、一 7 6 ％) ， 計(jì) 數(shù)備 用 。4 供鼠 N K細(xì)胞的體外培養(yǎng)擴(kuò)增和分離 兩步 粘 附 分 離 法 分 離 N K 細(xì) 胞【 2 , 9J 。 分 離 脾 淋 巴細(xì) 胞 ， 置 塑料 培養(yǎng)瓶 于 3 7o C， 5 ％ C 0 2 孵 箱 中培 養(yǎng) 2 4h 后 ， 第 一 步 粘 附 棄去 貼壁 細(xì) 胞 ； 懸 浮 細(xì) 胞 加 入 5×l o 5 —1 0 ×l o 5 U ／ L的 r h m一 2 繼續(xù)培

13、養(yǎng) 8 —1 0d ， 刺 激 N K細(xì) 胞擴(kuò) 增并 具一 定 的粘 附性 ， 第 二步 粘 附獲 取 貼 壁 的 N K細(xì) 胞 ， 抗 鼠 C D 3 一 F I T C和 N K 】 】 一P E抗 體 標(biāo) 記后 流式細(xì)胞儀檢測(cè) ( C D 3 一 N K 】 ． 】細(xì)胞 占 5 0 ％ 一6 o ％， 另文 報(bào)道 ) 。5 移植 分 組 按 移植 物不 同分為 5 組 ， 每組 受 鼠 1 6只 ( 其 中 6只 不進(jìn) 人生 存

14、期 觀察 ， 移 植 前 標(biāo) 記 序 號(hào) 分 別 于 移 植 后 1 、 2 、 3周處 死 作 骨髓 C細(xì) 胞 和病 理切 片檢 查 ) 。全部受鼠在接受 T B I 后 4 h經(jīng)尾靜 脈注入移植 物 ： ( 1 ) 空 白對(duì) 照 組 ： R P M I 一1 6 4 0液 0 ． 5m L ； ( 2 ) 單 純 異 基 因骨髓 組 ： 供 鼠骨髓 細(xì) 胞 4 ×1 0 6 ； ( 3 ) 骨髓 + T細(xì) 胞 組 ： 供

15、鼠骨髓 細(xì) 胞 4 × l o 6 +外周 T 細(xì) 胞 4 ×1 0 6 ； ( 4 )骨 髓 + N K細(xì)胞 組 ： 供 鼠骨髓 細(xì)胞 4 ×l o 6 +N K細(xì) 胞 1×l o 6 ； ( 5 ) 骨髓 + T 細(xì) 胞 + N K細(xì) 胞 組 ： 供 鼠骨 髓 細(xì) 胞 4×l o 6 +外周 T細(xì)胞 4×l o 6 +N K細(xì)胞 1 ×1 0 6 。6 觀測(cè) 指標(biāo)

16、 與 方法 維普資訊 http://www.cqvip.com 2 K rI n m¨o f 1 1 —2‘～ l ¨ j nT ? ng ： O u ~ “ j ?L ~' u m 仙 ? Ⅲ _^?f “1_ mm a r I【 Jl ； B：山 1 ? Tp 血 ?1 【 H n ⅢI ．c：扎 J? ? + NK , ~l l s, ~ o u p曲 r? 山 ? l ： DJt c

17、r m? +1c+M‘ Hcp血 r l圖 4 各組移植后 H一 2 K b + 細(xì) 胞表選 章與 移植前 受鼠 比較 4H一2 K細(xì)胞表達(dá)水平 幢刪長(zhǎng)期存 衙的 3 組受 鼠外周淋 巴細(xì)胞 中表 達(dá) I 1 一!細(xì)胞 的 自分串 ． 結(jié) 骨 髓 +N K銣 胞 絹 和 骨髓 +T細(xì) 胞 +K胞 姬 分 別 (±54 3 ) ％1 ( 熟 ±63 5 ) ％ ． 顯 著 高 丁 單 純 異 莘 骨 髓 紐 ( 4&

18、#177;03 2 ) ％ ( P(u0 1 )各 組 移 植 后 H一2 K細(xì) 胞喪 達(dá) 豐 與移 植 f j_ 受 鼠 比較 見(jiàn)固 4 。討 論 N K細(xì)胞效應(yīng)足 N K細(xì)胞妥體與主要 織相 窯性 I 型抗娘( M H Cc _ l 鼬 s I ) 分于柏互作用所 升導(dǎo)的澈動(dòng)和抑 信號(hào)之 問(wèn)競(jìng) 爭(zhēng)的結(jié) 果。在正 常生理 狀態(tài) F抑 制性侍號(hào) 占土導(dǎo)地位 ， 抑制性 N K細(xì)胞受體通過(guò)識(shí) 別自身 MH Cc l1 分 r 阻止 N