沉默CCR7基因后對(duì)樹突狀細(xì)胞在體外成熟影響的研究.pdf

1、目的和意義：近年來，諸多研究表明免疫炎癥反應(yīng)參與冠心病的發(fā)病機(jī)制，而作為免疫炎癥反應(yīng)中最為重要的抗原提呈細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞(DendriticCells，DCs)在免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。由于趨化因子受體CCR7在未成熟的樹突狀細(xì)胞(Immaturedendriticcells，imDCs)表面低表達(dá)，而在成熟的樹突狀細(xì)胞表面高表達(dá)，推測(cè)CCR7可能與DCs的成熟有著密切的關(guān)系。另外在免疫反應(yīng)的過程中imDC主要起著攝取抗原的作用，成

2、熟的DCs將攝取抗原呈遞給T淋巴細(xì)胞引起免疫炎癥反應(yīng)。CCR7能否調(diào)控DCs的成熟目前尚不清楚。本文通過體外原代分離培養(yǎng)大鼠骨髓源性樹突狀細(xì)胞(RatBoneMarrow-derivedDendriticCells，BMDCs)，進(jìn)一步通過形態(tài)學(xué)及其細(xì)胞表型進(jìn)行鑒定。同時(shí)構(gòu)建趨化因子受體CCR7的RNA干擾的慢病毒載體，進(jìn)一步轉(zhuǎn)染imDCs；轉(zhuǎn)染6天后，通過RT-PCR和WesternBlot分別檢測(cè)CCR7mRNA和蛋白的表達(dá)以及EL

3、ISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中巨噬細(xì)胞炎性蛋白1a(MIP-1a)和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的含量(由于相關(guān)研究表明隨著DCs的成熟培養(yǎng)上清液中MIP-1a分泌是逐漸降低的，MCP-1分泌是逐漸增高的)。探討沉默CCR7基因后對(duì)DCs成熟的影響，從而通過抑制DCs的成熟為動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病乃至于心血管疾病的治療提供新的思路。
　　 方法：體外分離培養(yǎng)及其鑒定大鼠骨髓源性樹突狀細(xì)胞：取出150-180g(雌雄不限)SD大

4、鼠雙下肢股骨和脛骨，用5ml注射器吸取含10％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基沖洗骨髓腔收集骨髓細(xì)胞，繼而用粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor，GM-CSF)5ng/ml和白細(xì)胞介素-4(Interleukin4，IL-4)5ng/ml誘導(dǎo)分化，培養(yǎng)至第6天收集懸浮細(xì)胞(即imDCs)，繼續(xù)用GM-CSF2.5-5ng/ml進(jìn)行分化培養(yǎng)，一般至12天可

5、獲得成熟的樹突狀細(xì)胞。分別收集第6天、9天、12天及14天BMDCs，通過形態(tài)學(xué)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型對(duì)BMDCs進(jìn)行鑒定。由吉?jiǎng)P公司完成RNA干擾慢病毒載體構(gòu)建和慢病毒包裝與滴度的檢測(cè)，獲得4個(gè)靶點(diǎn)的shRNA，通過RT-PCR檢測(cè)mRNA和WesternBlot檢測(cè)蛋白篩選最佳的靶點(diǎn)。本研究分為3個(gè)組：實(shí)驗(yàn)組為轉(zhuǎn)染CCR7-GFP-LV的DCs、陰性對(duì)照組為轉(zhuǎn)染NC-GFP-LV的DCs，空白對(duì)照組為正常培養(yǎng)的DCs。用篩選出最佳

6、的靶點(diǎn)CCR7-GFP-LV轉(zhuǎn)染第6天的樹突狀細(xì)胞，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染6天后通過RT-PCR和WesternBlot檢測(cè)各組CCR7mRNA和蛋白的表達(dá)水平，通過ELISA法檢測(cè)三個(gè)組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MIP-1a和MCP-1的含量，通過MTT法檢測(cè)CCR7沉默后對(duì)DCs生長(zhǎng)增殖情況的影響。
　　 結(jié)果：體外培養(yǎng)初期(6-9天)樹突狀細(xì)胞呈半懸浮狀態(tài)，圓形，無樹突；培養(yǎng)至后期(12天左右)呈半懸浮半貼壁狀態(tài)，圓形或橢圓形，部分細(xì)胞可見樹突狀

7、突起。流式細(xì)胞表型的鑒定結(jié)果示培養(yǎng)初期低表達(dá)CD86，中度表達(dá)MHC-Ⅱ，至培養(yǎng)后期CD86和MHC-Ⅱ的表達(dá)均增高。ELISA檢測(cè)結(jié)果示隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)MIP-1a含量逐漸降低，而MCP-1含量逐漸增高。由吉?jiǎng)P公司提供4個(gè)靶點(diǎn)，經(jīng)過RT-PCR和WesternBlot篩選出最佳靶點(diǎn)為CCR7-RNAi-LV3＃，其濃縮病毒滴度為6x108TU/ml.轉(zhuǎn)染CCR7shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染后6天(第12天DCs)，70-75％左右的BMDC

8、s表達(dá)GFP，RT-PCR結(jié)果顯示CCR7mRNA表達(dá)情況實(shí)驗(yàn)組(26.85±0.03)％與空白對(duì)照組(93.01±0.01)％和陰性對(duì)照組(83.69±0.01)％相比P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；WesternBlot結(jié)果示：CCR7蛋白表達(dá)情況實(shí)驗(yàn)組(47.86±0.02)％與空白對(duì)照組(93.50±0.05)％和陰性對(duì)照組(91.35±0.02)％相比P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；ELISA結(jié)果顯示MIP-1a含量實(shí)驗(yàn)組(30.

9、70±0.50)pg/ml與空白對(duì)照組(25.33±1.74)pg/ml和陰性對(duì)照組(26.95±0.22)pg/ml相比P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；MCP-1含量實(shí)驗(yàn)組(25.50±0.95)pg/ml與空白對(duì)照組(31.06±1.41)pg/ml和陰性對(duì)照組(31.44+1.95)pg/ml相比P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；MTT結(jié)果示：CCR7沉默后實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。