IL-6抑制單核細(xì)胞來源樹突狀細(xì)胞CCR7表達(dá)的機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:
　　DCs在調(diào)節(jié)人體免疫平衡、清除感染、對抗腫瘤中發(fā)揮著重要作用。近年來隨著對腫瘤認(rèn)識不斷深入，腫瘤免疫逃逸被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要原因之一。而樹突狀細(xì)胞與腫瘤免疫逃逸之間的關(guān)系是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。功能成熟的樹突狀細(xì)胞在攝取腫瘤抗原后可以激活CD8+T細(xì)胞，進(jìn)而清除腫瘤細(xì)胞。
　　在腫瘤發(fā)生發(fā)展的早期，樹突狀細(xì)胞通常能夠有效激活T細(xì)胞去殺傷腫瘤細(xì)胞。但是隨著腫瘤進(jìn)一步發(fā)展，樹突狀細(xì)胞往往處于失能狀態(tài)。腫瘤細(xì)胞通

2、過與其他基質(zhì)細(xì)胞相互作用、分泌免疫抑制因子等機(jī)制改變自身生存環(huán)境，形成具有促腫瘤生長、抑制免疫反應(yīng)特點(diǎn)的腫瘤微環(huán)境（tumour microenvironment，TME）。而在腫瘤微環(huán)境中，樹突狀細(xì)胞的分化成熟和遷移能力被抑制的。
　　在正常生理情況下，IL-6對樹突狀細(xì)胞生物學(xué)功能的發(fā)揮具有重要作用，但是腫瘤微環(huán)境中高水平的免疫抑制因子IL-6(interleukin-6)被證實(shí)是抑制樹突狀細(xì)胞分化成熟和遷移能力的重要因子。在

3、腫瘤微環(huán)境中，IL-6能抑制DCs共刺激分子和MHC類分子的表達(dá)，并且抑制CD34+前體細(xì)胞向DCs分化。在腫瘤微環(huán)境中樹突狀細(xì)胞通常低表達(dá)CCR7，而高表達(dá)CCR6、CCR2、CCR1、CCR5、CXCR4分子。而后者通常在不成熟樹突狀細(xì)胞和免疫耐受樹突狀細(xì)胞表面表達(dá)。而不成熟樹突狀細(xì)胞和免疫耐受樹突狀細(xì)胞都是具有免疫抑制性質(zhì)的。CCR7表達(dá)的缺失被證實(shí)會導(dǎo)致樹突狀細(xì)胞遷移障礙，最終導(dǎo)致機(jī)體免疫缺陷。最近有學(xué)者報道腫瘤細(xì)胞來源的IL-

4、6明顯抑制人單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞(human monocyte-derived dendritic cells，moDCs)CCR7的表達(dá)和moDCs的遷移能力，但其內(nèi)在分子機(jī)制還不清楚。在某些類型的腫瘤組織（宮頸癌）中腫瘤基質(zhì)里的樹突狀細(xì)胞高表達(dá)其成熟標(biāo)志CD83，但是低表達(dá)或不表達(dá)CCR7。所以IL-6通過抑制樹突狀細(xì)胞CCR7表達(dá)而阻止DCs向淋巴器官遷移，可能是導(dǎo)致腫瘤宿主免疫缺陷的原因之一。所以我們希望通過研究IL-6抑制

5、moDCs CCR7表達(dá)的內(nèi)在分子機(jī)制，找到能夠糾正moDCs遷移功能障礙的分子靶點(diǎn)，為糾正腫瘤患者的免疫缺陷提供新的策略。
　　研究方法:
　　1、采用磁珠分選(Magnetic-Activated Cell Sorting，MACS)法從人外周血中分選出CD14+單核細(xì)胞，使用含青鏈雙抗的10％RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為5％CO2、37℃。并補(bǔ)充細(xì)胞因子rhGM-CSF800U/ml、rhIL-4500

6、U/ml進(jìn)行moDCs的誘導(dǎo)分化。細(xì)胞每隔兩天半量更換培養(yǎng)基，并補(bǔ)充丟失的rhIL-4，rhGM-CSF。在培養(yǎng)的第3天，加入不同劑量的IL-6，使其終濃度為50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml。在培養(yǎng)第6天，加入LPS(100ng/ml)刺激48h后，收獲moDCs，流式分析檢測CD86、CD83以及HLA-DR的表達(dá)水平。定量RT-PCR檢測CCR7mRNA的表達(dá)。
　　2、在第一部分實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，擬對IL-6抑

7、制moDCsCCR7表達(dá)的分子機(jī)制進(jìn)行研究。由于IL-6有兩條關(guān)鍵的下游信號通路:gp130 Tyr759-SHP-2/ERK信號通路和gp130 YXXQ-JAK/STAT3信號通路，所以我們通過western blotting檢測IL-6處理的moDCs細(xì)胞內(nèi)p-STAT3和p-ERK1/2的表達(dá)情況。
　　3、在第二部分實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，我們使用了p-STAT3抑制劑JSI-124與p-ERK1/2抑制劑PD98059分別抑制I

8、L-6處理后moDCs細(xì)胞內(nèi)p-STAT3和p-ERK1/2的表達(dá)。定量RT-PCR分別檢測JSI-124與PD98059對IL-6抑制moDCs CCR7mRNA表達(dá)的影響。流式分析檢測JSI-124對IL-6抑制moDCsCCR7表達(dá)的影響。Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測JSI-124對IL-6抑制moDCs遷移的影響。
　　研究結(jié)果:
　　1、通過rhGM-CSF、rhIL-4聯(lián)合誘導(dǎo)法，培養(yǎng)得到具有典型樹突形態(tài)的

9、人單核細(xì)胞來源樹突狀細(xì)胞。LPS刺激獲得成熟的樹突狀細(xì)胞。流式分析發(fā)現(xiàn)，終濃度為50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml的IL-6對moDCs的表型成熟分子:CD86、CD83、HLA-DR的表達(dá)沒有抑制作用。IL-6(50ng/ml)+LPS組DC86/DC83/HLA-DR表達(dá)率分別為90.1±1.2、81.2±1.5、94.6±1.8。IL-6(100ng/ml)+LPS組DC86/DC83/HLA-DR表達(dá)率分別為96

10、.2±1.6、86.9±0.9、87.7±±1.3。IL-6(150ng/ml)+LPS組DC86/DC83/HLA-DR表達(dá)率分別為91.3±1.2、91.0±1.6、87.0±1.7。與LPS單獨(dú)處理組（LPS組DC86/DC83/HLA-DR表達(dá)率分別為92.6±1.7、82.0±1.2、93.4±1.4）相比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。而定量RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)終濃度為50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml的IL

11、-6能明顯抑制moDCs CCR7mRNA的表達(dá)(CCR7mRNA的相對表達(dá)量依次為0.760±0.079、0.440±0.029、0.435±0.059)，并與LPS單獨(dú)處理組（1.246±0.102）相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(P＜0.05)。
　　2、western blotting檢測發(fā)現(xiàn)IL-6處理組moDCs p-STAT3、p-ERK1/2的表達(dá)明顯高于LPS單獨(dú)處理組。終濃度為50ng/ml、100ng/ml、150ng

12、/ml的IL-6處理組p-STAT3的相對表達(dá)量依次為:1.240±0.092、1.438±0.105、1.875±0.127，與LPS單獨(dú)處理組（0.724±0.086）相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。終濃度為50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml的IL-6處理組p-ERK的相對表達(dá)量依次為:1.085±0.067、1.071±0.082、0.856±0.039，與LPS單獨(dú)處理組（0.359±0.024）相比較有統(tǒng)計(jì)

13、學(xué)差異(P＜0.05)。
　　3、western blotting檢測發(fā)現(xiàn)JSI-124和PD98059能分別抑制IL-6導(dǎo)致的p-STAT3和p-ERK1/2過度活化。IL-6(100ng/ml)+JSI-124組p-STAT3相對表達(dá)量為0.841±0.018，低于IL-6(100ng/ml)單獨(dú)處理組（1.388±0.090）(P＜0.05)。IL-6(100ng/ml)+PD98059組p-ERK相對表達(dá)量為0.389±0

14、.076，低于IL-6100ng/ml單獨(dú)處理組（0.688±0.082）(P＜0.05)。定量RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)JSI-124能逆轉(zhuǎn)IL-6對moDCsCCR7mRNA的表達(dá)，IL-6（100ng/ml）+JSI-124+LPS組moCCR7 mRNA相對表達(dá)量為0.640±0.101，明顯高于IL-6(100ng/ml)+LPS組（0.219±0.018）(P＜0.05)。PD98059卻不能。IL-6(100ng/ml)+PD9

15、8059+LPS組moCCR7 mRNA相對表達(dá)量為0.260±0.038，與IL-6(100ng/ml)+LPS組相比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。流式分析檢測發(fā)現(xiàn)JSI-124能逆轉(zhuǎn)IL-6對moDCsCCR7表達(dá)的抑制，IL-6(100ng/ml)+JSI-124+LPS組moDCs CCR7表達(dá)率為83.0±1.2，明顯高于IL-6(100ng/ml)+LPS組（15.4±0.9）(P＜0.05)。Transwell細(xì)胞遷移實(shí)

16、驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)JSI-124還能逆轉(zhuǎn)IL-6對moDCs遷移的抑制，IL-6(100ng/ml)+JSI-124+LPS組moDCs的遷移率為74.5±3.3，明顯高于IL-6(100ng/ml)+LPS組（26.2±2.1）(P＜0.05)。
　　研究結(jié)論:
　　1、IL-6對moDCs的表型成熟分子DC86、DC83、HLA-DR的表達(dá)沒有抑制作用，而對moDCsCCR7mRNA的表達(dá)有明顯抑制作用。
　　2、IL-6

17、能明顯激活moDCs內(nèi)STAT3信號通路和ERK信號通路。
　　3、JSI-124抑制p-STAT3表達(dá)后，能逆轉(zhuǎn)IL-6對moDCs CCR7mRNA表達(dá)的抑制，而p-ERK抑制劑PD98059卻不能。而且JSI-124還能逆轉(zhuǎn)IL-6對moDCsCCR7表達(dá)和遷移能力的抑制。結(jié)果提示IL-6通過STAT3信號通路，而不通過ERK信號通路抑制moDCsCCR7的表達(dá)和細(xì)胞遷移能力。STAT3可能成為干預(yù)moDCs遷移障礙的分子靶