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文檔簡介
1、目的:深入探討STIM1/STIM2對人外周血單核細胞來源的樹突狀細胞(DCs)表型及免疫功能的影響,包括形態(tài)學、細胞表型、吞噬功能及刺激淋巴細胞增殖的能力,以期揭示STIM1/STIM2在自身免疫性疾病(AID)發(fā)病機制中的重要作用。方法:取正常人外周血密度梯度離心法及連續(xù)貼壁法分離單核細胞,細胞因子重組粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、白細胞介素-4(IL-4)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘導分化獲得DCs。采用核醣
2、核酸干擾(RNAi)技術(shù),脂質(zhì)體法將STIM1 siRNA與STIM2 siRNA分別轉(zhuǎn)入DCs并設立對照,即對照組、DCs-iSTIM1組、DCs-iSTIM2組。(1)倒置相差顯微鏡、透射電鏡(TEM)及掃描電鏡(SEM)下觀察比較各組DCs在形狀、大小、突起、細胞超微結(jié)構(gòu)等方面的形態(tài)學差異;(2)采用直接免疫熒光標記法及流式細胞儀(FCM)技術(shù)鑒定各組DCs表型HLA-DR、CD1a、CD83、CD80、CD86、CD40表達陽性
3、的細胞百分比和平均熒光強度值,以分別比較DCs-iSTIM1組、DCs-iSTIM2組與對照組之間HLA-DR、CD1a、CD83、CD80、CD86、CD40表達量及平均熒光強度的差異;(3)將DCs與FITC-葡聚糖微球(dextran)相互作用,采用FCM檢測PE-CD11c和FITC-dextran雙陽性細胞占CD11c陽性細胞百分比,對比各組DCs對dextran的吞噬能力,以評價干擾STIM1或STIM2對DCs吞噬能力的影
4、響;(4)誘導DCs同種異體混合淋巴細胞反應(MLR),四甲基偶氮唑鹽(MTT)細胞增殖檢測實驗測定各組淋巴細胞增殖情況,比較各組之間OD值的差異以評價干擾STIM1或STIM2對DCs刺激淋巴細胞增殖能力的影響。結(jié)果:(1)TEM觀察下,與對照組相比,DCs-iSTIM1組和DCs-iSTIM2組DCs的細胞突觸更細、多、長,部分可見突起相互交叉成網(wǎng)格狀;腫脹線粒體數(shù)目增多,腫脹程度增加,甚至出現(xiàn)小空泡狀結(jié)構(gòu);但是,在倒置相差顯微鏡和
5、SEM觀察下,三組之間的DCs形態(tài)學表現(xiàn)無明顯差異;(2)FCM檢測細胞表型HLA-DR、CD1a、CD83、CD80、CD86、CD40陽性細胞的百分比及平均熒光強度值。DCs-iSTIM1組與DCs-iSTIM2組共刺激分子 CD83、CD80、CD86、CD40的表達量較對照組顯著增加(CD83、CD80、CD86檢測中P值<0.01,CD40檢測中P值<0.05),而共刺激分子CD1a與MHCΠ類分子HLA-DR的表達量無明顯差
6、異;但HLA-DR的平均熒光強度在DCs-iSTIM1組與DCs-iSTIM2組均明顯增強(P值<0.05);(3)FCM檢測熒光雙陽性細胞占FE-CD11c陽性細胞百分比結(jié)果顯示,干擾STIM1或STIM2后DCs的吞噬功能較對照組有明顯降低(P值<0.05);(4)MTT比色法檢測MLR中各組細胞的OD值,結(jié)果顯示干擾STIM1或STIM2能顯著增強DCs刺激淋巴細胞增殖的能力,以DCs與淋巴細胞混合比例為1:5和1:1最明顯(P值
7、均<0.01)。結(jié)論:(1) STIM1/STIM2缺陷能夠改變DCs形態(tài)學表現(xiàn):干擾STIM1或STIM2誘導DCs的細胞突起更細、多、長,可能與STIM1或STIM2缺陷能促進DCs成熟相關(guān);同時,干擾STIM1促使DCs腫脹線粒體增多、腫脹程度增加,可能與促進DCs細胞代謝活動增強或DCs程序性死亡增加有關(guān);(2)STIM1/STIM2缺陷能夠促進DCs成熟:干擾STIM1或STIM2促使共刺激分子CD83高表達,能顯著抑制DCs
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