乙肝后肝硬化患者外周血單核細(xì)胞的表型與功能研究.pdf

1、全球約有3.5億人感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV),約25％慢性乙肝患者最終將發(fā)展為肝硬化。肝硬化是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命和健康的慢性疾病,如何有效的阻斷、抑制或逆轉(zhuǎn)肝硬化仍是當(dāng)前臨床治療的重要難題。目前認(rèn)為,機(jī)體免疫系統(tǒng)在肝硬化形成過(guò)程中扮演關(guān)鍵角色。免疫調(diào)節(jié)功能紊亂可能是肝硬化形成、進(jìn)展的重要因?yàn)?。更好的了解肝硬化患者的免疫狀態(tài),可能為乙型肝炎后肝硬化的干預(yù)治療提供方向。
　　 單核/巨噬細(xì)胞是機(jī)

2、體內(nèi)重要的固有免疫細(xì)胞,是機(jī)體免疫防御的第一道防線。肝硬化患者往往存在不同水平的內(nèi)毒素血癥,而內(nèi)毒素是單核細(xì)胞活化、發(fā)揮效應(yīng)功能的重要配體；研究發(fā)現(xiàn),單核細(xì)胞接受刺激后可大量分泌TNF-α等炎性介質(zhì),可能進(jìn)而介導(dǎo)肝臟纖維化的形成,特別是目前鑒定的一群CD14+CD16+單核細(xì)胞,有極強(qiáng)的炎性細(xì)胞因子分泌能力,被稱(chēng)為促炎癥反應(yīng)單核細(xì)胞。因此,單核細(xì)胞與肝硬化的病理生理過(guò)程密切相關(guān),可能在肝臟炎癥和纖維化的形成過(guò)程中扮演重要角色。
　

3、　 目前,對(duì)于肝硬化患者外周血單核細(xì)胞的特點(diǎn)和功能狀態(tài)尚缺乏系統(tǒng)的報(bào)道。因此,通過(guò)研究肝硬化患者外周血單核細(xì)胞的表型、功能特點(diǎn)、與肝硬化患者不同的臨床分期之間的關(guān)系,明確肝硬化患者外周血單核細(xì)胞的功能狀態(tài),為我們進(jìn)一步了解肝硬化的形成機(jī)制、免疫病理狀態(tài)及采取可能的干預(yù)措施提供理論依據(jù)。
　　 目的:以健康人和慢性乙型肝炎患者作為對(duì)照,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)及胞內(nèi)細(xì)胞因子染色方法闡述不同分期的肝硬化患者外周血單核細(xì)胞的表型特點(diǎn)和功能狀態(tài)

4、。
　　 方法:
　　 1.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血單核細(xì)胞表型:隨機(jī)選擇肝硬化患者35例,其中代償期肝硬化15人,失代償期肝硬化20人。選擇慢性乙型肝炎患者25例、健康組10例作為對(duì)照?？鼓裳懿赏庵苎?0ml,應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后按染色方案分管,用CD14圈定單核細(xì)胞,檢測(cè)其CD16,CD80及HLA—DR所占的百分比。
　　 2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血單核細(xì)胞胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá):

5、分離出的單個(gè)核細(xì)胞分3組進(jìn)行體外培養(yǎng),分別加入LPS進(jìn)行刺激,其終濃度為0.1μg/ml,1μg/ml,10μg/ml。1小時(shí)后加入阻斷劑Monensin,繼續(xù)培養(yǎng)5小時(shí)。然后按照染色方案進(jìn)行表面染色、破膜及胞內(nèi)細(xì)胞因子染色,用流式細(xì)胞儀圈定CD14+單核細(xì)胞,檢測(cè)TNFα,IL-10所占的百分比。
　　 3.早期細(xì)胞凋亡的檢測(cè):分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞體外培養(yǎng)24小時(shí),用CD14、AnnexinⅤ-FITC和PI染色后,應(yīng)用流式

6、細(xì)胞儀檢測(cè)CD14陽(yáng)性細(xì)胞百分比中AnnexinⅤ陽(yáng)性比例。
　　 4.采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)ALT、ALB、GLB、TBIL等。采用自動(dòng)血凝儀檢測(cè)PT。彩色超聲多普勒檢測(cè)肝硬化患者腹水情況。根據(jù)患者癥狀及體格檢查判斷肝硬化患者有無(wú)肝性腦病,對(duì)存在肝性腦病患者進(jìn)行分期。
　　 結(jié)果:
　　 1肝硬化患者外周血單核細(xì)胞的頻率、表型及細(xì)胞因子表達(dá)特點(diǎn):
　　 1.1肝硬化患者外周血單核細(xì)胞的頻率特點(diǎn):檢測(cè)的70

7、例標(biāo)本中,肝硬化患者35例,其中代償期肝硬化15人,失代償期肝硬化20人,慢性乙肝組25例,健康對(duì)照組10例。其中健康對(duì)照組、慢性乙肝組、代償期肝硬化組及失代償期肝硬化組CD14+單核細(xì)胞的頻率分別為:(11.46±5.06)％,(11.94±4.72)％,(14.97±6.56)％,(22.89±8.98)％。其中健康對(duì)照組與慢性乙肝組及代償期肝硬化組比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05),而健康對(duì)照組與失代償期肝硬化組比較,代償期肝硬化

8、與失代償期肝硬化組比較,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 1.2肝硬化患者外周血CD14+CD16+單核細(xì)胞的頻率:健康對(duì)照組、慢性乙肝組、代償期肝硬化組及失代償期肝硬化組CD16+CD14+單核細(xì)胞占CD14+陽(yáng)性單核細(xì)胞的比例分別為:(4.56±2.74)％,(6.18±3.95)％,(8.68±2.78)％,(14.61±6.61)％。其中健康對(duì)照組與慢性乙肝組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。而健康對(duì)照組與代償期肝

9、硬化組、失代償期肝硬化組比較,代償期肝硬化與失代償期肝硬化組比較,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 1.3肝硬化患者外周血單核細(xì)胞HLA-DR的表達(dá)水平:健康對(duì)照組、慢性乙肝組、代償期肝硬化組及失代償期肝硬化組的單核細(xì)胞HLA-DR的表達(dá)分別為:(83.59±11.19)％,(83.87±10.78)％,(70.21±11.58)％,(55.92±11.55)％。其中健康對(duì)照組與慢性乙肝組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

10、而與健康對(duì)照組相比,代償期肝硬化組、失代償期肝硬化組HLA-DR的表達(dá)水平均明顯降低,組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而代償期肝硬化與失代償期肝硬化組比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 1.4肝硬化患者外周血單核細(xì)胞CD80的表達(dá)水平:健康對(duì)照組、慢性乙肝組、代償期肝硬化組及失代償期肝硬化組單核細(xì)胞CD80的表達(dá)分別為:(5.98±3.38)％,(5.59±3.10)％,(5.78±2.51)％,(6.44±2.

11、17)％。四組之間兩兩比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 1.5肝硬化患者外周血單核細(xì)胞分泌TNF-α的能力:健康對(duì)照組、慢性乙肝組、代償期肝硬化組及失代償期肝硬化組單核細(xì)胞分泌TNF-α的水平分別為:(39.28±12.26)％,(35.88±10.93)％,(41.53±13.05)％,(57.85±11.73)％。其中健康對(duì)照組與慢性乙肝組及代償期肝硬化組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而健康對(duì)照組與失代償期肝

12、硬化組比較,代償期肝硬化與失代償期肝硬化組比較,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 1.6肝硬化患者外周血單核細(xì)胞分泌IL-10的能力:健康對(duì)照組、慢性乙肝組、代償期肝硬化組及失代償期肝硬化組的單核細(xì)胞分泌IL-10的水平分別為:(2.21±2.26)％,(2.43±1.99)％,(2.13±1.11)％,(2.34±2.14)％。四組之間兩兩比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(Fig.7)。
　　 1.7肝硬化患者

13、外周血單核細(xì)胞早期凋亡的檢測(cè):分別檢測(cè)16例標(biāo)本中,健康對(duì)照組7例,失代償期肝硬化組9例。兩組中膜聯(lián)蛋白Ⅴ陽(yáng)性的單核細(xì)胞頻率分別為:(4.77±3.50)％,(15.02±8.09)％。組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 2肝硬化患者外周血單核細(xì)胞功能試驗(yàn):
　　 三組不同濃度的LPS刺激后CD14+單核細(xì)胞所分泌的TNF-α及IL-10的能力:檢測(cè)16例標(biāo)本中,其中健康對(duì)照組8例,失代償期肝硬化組8例,分別

14、應(yīng)用三組不同濃度LPS刺激后,檢測(cè)TNF-α,IL-10的水平。結(jié)果顯示,健康對(duì)照組CD14+單核細(xì)胞分泌TNF-α、IL-10的水平隨著刺激濃度的增加而明顯升高,而失代償期肝硬化組TNF-α、IL-10的水平則隨著LPS濃度的增加升高不明顯。
　　 結(jié)論:肝硬化患者外周血單核細(xì)胞及其亞型(CD14+CD16+單核細(xì)胞)頻率均增加,HLA—DR表達(dá)水平降低,產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子TNF—α增加。且應(yīng)用不同濃度的LPS刺激,刺激劑的濃度