外周血單核細胞移植治療肝硬化的實驗研究.pdf

1、失代償性肝硬化（LC）是一種常見的終末期肝病。常規(guī)的內(nèi)科治療雖能改善臨床癥狀，卻不能逆轉(zhuǎn)肝細胞數(shù)量日益減少導致的肝功能逐漸減退。原位肝移植是目前最有效的治療失代償性肝硬化的方法，但因供肝缺乏、免疫排斥、手術(shù)風險、費用昂貴等諸多因素，限制了臨床的廣泛應用，因而，急需尋找一種新的治療技術(shù)。
　　近年來，干細胞在再生領(lǐng)域所取得的巨大進展為肝病的治療提供了新的視角。國內(nèi)外大量研究表明，骨髓來源的干細胞具有跨胚層分化的潛能，如在適宜的體內(nèi)外

2、環(huán)境下，可向內(nèi)胚層的肝細胞分化。1999年，Petersen等首次報道了大鼠骨髓干細胞可以分化為肝卵圓細胞，進而分化為肝細胞和膽管上皮細胞，這是干細胞用于肝病治療的一個里程碑式實驗，為近年來骨髓源性干細胞在肝硬化治療領(lǐng)域所取得的成就，也提示著其具有向肝細胞分化的潛能，有望為急性肝衰竭、終末期肝病和遺傳代謝性肝病的治療帶來新希望。
　　我科經(jīng)第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院倫理委員會的批準，已完成了20例自體PBMCs移植治療失代償性肝硬化的臨

3、床試驗，結(jié)果顯示PBMCs移植能在一定程度上改善失代償性肝硬化患者的肝功能。但是，導致這一良好臨床療效的機制還不清楚，本課題將通過體內(nèi)外實驗對其進行探討。
　　【目的】
　　1、研究源自失代償性肝硬化患者的PBMCs在體外能否向肝樣細轉(zhuǎn)化；2、探討源自失代償性肝硬化患者的PBMCs能否在裸鼠肝內(nèi)定植、分化，并表達人肝細胞的標志物；3、建立失代償性肝硬化的動物模型，研究PBMCs移植對肝硬化大鼠的治療作用；4、比較單純G-CS

4、F動員治療及G-CSF動員聯(lián)合PBMCs移植治療兩種方案對肝硬化治療效果，并探討其可能的機制。
　　【方法】
　　1、利用重組人肝細胞生長因子及表皮生長因子-4對從肝硬化病人分離的PBMCs進行體外誘導，用倒置顯微鏡對誘導細胞進行形態(tài)觀察；2、采用細胞免疫化學、PAS染色、RT-PCR、WesternBlot檢測誘導細胞肝細胞特異的分子表達；3、采用ELISA方法檢測誘導細胞上清中肝細胞合成、分泌及排泄的物質(zhì)；4、采用PKH

5、26-GL紅色熒光標記技術(shù)，將分離的PBMCs進行體外標記及體內(nèi)示蹤；5、通過PRINS技術(shù)，采用人的性別決定基因SRY、及鼠的性別基因SRY對移植細胞進行體內(nèi)示蹤；6、采用免疫組織化學、RT-PCR、WesternBlot技術(shù)檢測接受肝硬化病人的PBMCs移植的裸鼠肝內(nèi)是否有人肝細胞標志物表達；7、采用0.6％CCl4橄欖油，按0.3ml/100g的劑量，每隔3天經(jīng)腹膜內(nèi)注射一次，連續(xù)16周，制造SD大鼠的肝硬化模型；8、采用大鼠全自

6、動生化分析儀檢測移植前肝硬化大鼠的肝功能及各種治療后不同時間點大鼠肝功能；9、通過組織標本HE染色觀察不同處理組肝硬化大鼠的病理學改變；10、數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件，用t檢驗、秩和檢驗及單因素方差分析對資料進行統(tǒng)計分析。
　　【結(jié)果】
　　1將體外成功源自肝硬化病人的PBMCs誘導成肝樣細胞
　　采用密度梯度離心法分離了經(jīng)G-CSF動員的肝硬化病人的PBMCs，體外利用HGF、FGF-4

7、聯(lián)合誘導7天后，觀察到PBMCs呈多邊形、卵圓形等類似肝樣細胞的形態(tài)。細胞免疫化學、RT-PCR、WesternBlot及ELISA的結(jié)果表明這些具有肝樣細胞形態(tài)的細胞同時具有某些肝細胞的功能，如有CK18、ALB、CYP3A4等標志物的表達。這些結(jié)果提示源自肝硬化病人的PBMCs在體外經(jīng)誘導能向肝樣細胞轉(zhuǎn)化。
　　2PBMCs能定植于裸鼠的肝，表人的細標肝胞志物臟并達
　　先前Wang等研究表明，經(jīng)外周靜脈輸入純化的人造血

8、干細胞給免疫缺陷小鼠，接著給予CCl4誘發(fā)受體鼠肝功能損傷，1月后在受體鼠肝內(nèi)檢測到表達人類ALB的肝細胞。本研究采用將肝硬化病人PBMCs移植入急性肝臟損傷的裸鼠體內(nèi)，觀察其定植、分化的情況。PKH26及SRY示蹤的結(jié)果顯示移植的PBMCs能定植于裸鼠的肝臟。而且，我們在裸鼠的肝組織內(nèi)還檢測到人肝細胞標志物ALB、CK18的表達。這些結(jié)果提示，源自肝硬化病人的PBMCs能遷移、定植于裸鼠的肝臟，并在肝內(nèi)微環(huán)境下向肝細胞轉(zhuǎn)化。
　

9、　3成功建立了肝硬化物模型并，從觀動中察到的PBMCs動員的治作用療
　　CCl4造成大鼠慢性肝損傷12w時，其肝功指標與正常對照組具有顯著性差異（P<0.01），肝臟病理組織學提示大鼠肝硬化形成，在此基礎(chǔ)上繼續(xù)造模4w，制造失代償性肝硬化動物模型。將雌性肝硬化大鼠分4組（T1、C1、T2、C2）。T1組接受經(jīng)動員的雄性肝硬化大鼠的PBMCs移植，C1組為其對照組；T2組經(jīng)G-CSF動員后行PBMCs移植，C2組單純接受G-CSF

10、動員治療并作為T2組的對照組。PBMCs移植術(shù)后2w、2m，T1組與C1組相比，血清ALT、AST、TBIL均下降（P＜0.05），而血清ALB升高（P＜0.05）；T2組與C2組相比，血清ALT、AST、TBIL均下降，兩組間有顯著性差異（P＜0.05），而兩組血清ALB水平則均升高，無顯著性差異（P＞0.05）。
　　在移植術(shù)后的第2w和第2m，實驗組大鼠肝內(nèi)均發(fā)現(xiàn)有散在PKH26標記的紅色熒光的細胞，而對照組大鼠在相應時間點

11、未見有PKH26標記的細胞。在上述時間點，在接受雄性肝硬化大鼠PBMCs移植的雌性肝硬化大鼠肝內(nèi)還檢測到SRY的表達，而對照組大鼠肝內(nèi)則未檢測到SRY的表達。這些結(jié)果提示移植的PBMCs能定植于肝硬化大鼠的肝臟。
　　移植術(shù)后6m處死各治療組大鼠，取其肝組織行病理組織學檢查，結(jié)果顯示：T1與C1組，T2組與C2組，大鼠肝細胞壞死、脂肪變性、炎癥細胞浸潤程度均減輕，兩組半定量分級評分顯示差異不具有顯著性（P＞0.05），而肝纖維化病

12、變改變程度，兩組半定量分級評分顯示差異具有顯著性（P＜0.05）。這一結(jié)果提示造模停止6月后，CCl4誘導的肝硬化模型大鼠的肝細胞壞死，脂肪變性等病變可能通過自體肝細胞的增殖而修復，但纖維化改變不可逆，經(jīng)PBMCs移植，或單純G-CSF動員治療后，纖維化程度明顯減輕。
　　【結(jié)論】
　　本研究揭示了肝硬化患者的PBMCs在體外能分化成肝樣細胞，在體內(nèi)可以定植于損傷的肝臟，并在其微環(huán)境下向肝細胞轉(zhuǎn)化。在肝硬化動物模型上的研究結(jié)