外周血單核細(xì)胞移植治療肝硬化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、失代償性肝硬化（LC）是一種常見的終末期肝病。常規(guī)的內(nèi)科治療雖能改善臨床癥狀，卻不能逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞數(shù)量日益減少導(dǎo)致的肝功能逐漸減退。原位肝移植是目前最有效的治療失代償性肝硬化的方法，但因供肝缺乏、免疫排斥、手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)、費(fèi)用昂貴等諸多因素，限制了臨床的廣泛應(yīng)用，因而，急需尋找一種新的治療技術(shù)。
　　近年來，干細(xì)胞在再生領(lǐng)域所取得的巨大進(jìn)展為肝病的治療提供了新的視角。國內(nèi)外大量研究表明，骨髓來源的干細(xì)胞具有跨胚層分化的潛能，如在適宜的體內(nèi)外

2、環(huán)境下，可向內(nèi)胚層的肝細(xì)胞分化。1999年，Petersen等首次報(bào)道了大鼠骨髓干細(xì)胞可以分化為肝卵圓細(xì)胞，進(jìn)而分化為肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞，這是干細(xì)胞用于肝病治療的一個(gè)里程碑式實(shí)驗(yàn)，為近年來骨髓源性干細(xì)胞在肝硬化治療領(lǐng)域所取得的成就，也提示著其具有向肝細(xì)胞分化的潛能，有望為急性肝衰竭、終末期肝病和遺傳代謝性肝病的治療帶來新希望。
　　我科經(jīng)第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，已完成了20例自體PBMCs移植治療失代償性肝硬化的臨

3、床試驗(yàn)，結(jié)果顯示PBMCs移植能在一定程度上改善失代償性肝硬化患者的肝功能。但是，導(dǎo)致這一良好臨床療效的機(jī)制還不清楚，本課題將通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行探討。
　　【目的】
　　1、研究源自失代償性肝硬化患者的PBMCs在體外能否向肝樣細(xì)轉(zhuǎn)化；2、探討源自失代償性肝硬化患者的PBMCs能否在裸鼠肝內(nèi)定植、分化，并表達(dá)人肝細(xì)胞的標(biāo)志物；3、建立失代償性肝硬化的動(dòng)物模型，研究PBMCs移植對(duì)肝硬化大鼠的治療作用；4、比較單純G-CS

4、F動(dòng)員治療及G-CSF動(dòng)員聯(lián)合PBMCs移植治療兩種方案對(duì)肝硬化治療效果，并探討其可能的機(jī)制。
　　【方法】
　　1、利用重組人肝細(xì)胞生長因子及表皮生長因子-4對(duì)從肝硬化病人分離的PBMCs進(jìn)行體外誘導(dǎo)，用倒置顯微鏡對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)觀察；2、采用細(xì)胞免疫化學(xué)、PAS染色、RT-PCR、WesternBlot檢測誘導(dǎo)細(xì)胞肝細(xì)胞特異的分子表達(dá)；3、采用ELISA方法檢測誘導(dǎo)細(xì)胞上清中肝細(xì)胞合成、分泌及排泄的物質(zhì)；4、采用PKH

5、26-GL紅色熒光標(biāo)記技術(shù)，將分離的PBMCs進(jìn)行體外標(biāo)記及體內(nèi)示蹤；5、通過PRINS技術(shù)，采用人的性別決定基因SRY、及鼠的性別基因SRY對(duì)移植細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)示蹤；6、采用免疫組織化學(xué)、RT-PCR、WesternBlot技術(shù)檢測接受肝硬化病人的PBMCs移植的裸鼠肝內(nèi)是否有人肝細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)；7、采用0.6％CCl4橄欖油，按0.3ml/100g的劑量，每隔3天經(jīng)腹膜內(nèi)注射一次，連續(xù)16周，制造SD大鼠的肝硬化模型；8、采用大鼠全自

6、動(dòng)生化分析儀檢測移植前肝硬化大鼠的肝功能及各種治療后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠肝功能；9、通過組織標(biāo)本HE染色觀察不同處理組肝硬化大鼠的病理學(xué)改變；10、數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，用t檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)及單因素方差分析對(duì)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　【結(jié)果】
　　1將體外成功源自肝硬化病人的PBMCs誘導(dǎo)成肝樣細(xì)胞
　　采用密度梯度離心法分離了經(jīng)G-CSF動(dòng)員的肝硬化病人的PBMCs，體外利用HGF、FGF-4

7、聯(lián)合誘導(dǎo)7天后，觀察到PBMCs呈多邊形、卵圓形等類似肝樣細(xì)胞的形態(tài)。細(xì)胞免疫化學(xué)、RT-PCR、WesternBlot及ELISA的結(jié)果表明這些具有肝樣細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞同時(shí)具有某些肝細(xì)胞的功能，如有CK18、ALB、CYP3A4等標(biāo)志物的表達(dá)。這些結(jié)果提示源自肝硬化病人的PBMCs在體外經(jīng)誘導(dǎo)能向肝樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
　　2PBMCs能定植于裸鼠的肝，表人的細(xì)標(biāo)肝胞志物臟并達(dá)
　　先前Wang等研究表明，經(jīng)外周靜脈輸入純化的人造血

8、干細(xì)胞給免疫缺陷小鼠，接著給予CCl4誘發(fā)受體鼠肝功能損傷，1月后在受體鼠肝內(nèi)檢測到表達(dá)人類ALB的肝細(xì)胞。本研究采用將肝硬化病人PBMCs移植入急性肝臟損傷的裸鼠體內(nèi)，觀察其定植、分化的情況。PKH26及SRY示蹤的結(jié)果顯示移植的PBMCs能定植于裸鼠的肝臟。而且，我們?cè)诼闶蟮母谓M織內(nèi)還檢測到人肝細(xì)胞標(biāo)志物ALB、CK18的表達(dá)。這些結(jié)果提示，源自肝硬化病人的PBMCs能遷移、定植于裸鼠的肝臟，并在肝內(nèi)微環(huán)境下向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
　

9、　3成功建立了肝硬化物模型并，從觀動(dòng)中察到的PBMCs動(dòng)員的治作用療
　　CCl4造成大鼠慢性肝損傷12w時(shí)，其肝功指標(biāo)與正常對(duì)照組具有顯著性差異（P<0.01），肝臟病理組織學(xué)提示大鼠肝硬化形成，在此基礎(chǔ)上繼續(xù)造模4w，制造失代償性肝硬化動(dòng)物模型。將雌性肝硬化大鼠分4組（T1、C1、T2、C2）。T1組接受經(jīng)動(dòng)員的雄性肝硬化大鼠的PBMCs移植，C1組為其對(duì)照組；T2組經(jīng)G-CSF動(dòng)員后行PBMCs移植，C2組單純接受G-CSF

10、動(dòng)員治療并作為T2組的對(duì)照組。PBMCs移植術(shù)后2w、2m，T1組與C1組相比，血清ALT、AST、TBIL均下降（P＜0.05），而血清ALB升高（P＜0.05）；T2組與C2組相比，血清ALT、AST、TBIL均下降，兩組間有顯著性差異（P＜0.05），而兩組血清ALB水平則均升高，無顯著性差異（P＞0.05）。
　　在移植術(shù)后的第2w和第2m，實(shí)驗(yàn)組大鼠肝內(nèi)均發(fā)現(xiàn)有散在PKH26標(biāo)記的紅色熒光的細(xì)胞，而對(duì)照組大鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)

11、未見有PKH26標(biāo)記的細(xì)胞。在上述時(shí)間點(diǎn)，在接受雄性肝硬化大鼠PBMCs移植的雌性肝硬化大鼠肝內(nèi)還檢測到SRY的表達(dá)，而對(duì)照組大鼠肝內(nèi)則未檢測到SRY的表達(dá)。這些結(jié)果提示移植的PBMCs能定植于肝硬化大鼠的肝臟。
　　移植術(shù)后6m處死各治療組大鼠，取其肝組織行病理組織學(xué)檢查，結(jié)果顯示：T1與C1組，T2組與C2組，大鼠肝細(xì)胞壞死、脂肪變性、炎癥細(xì)胞浸潤程度均減輕，兩組半定量分級(jí)評(píng)分顯示差異不具有顯著性（P＞0.05），而肝纖維化病

12、變改變程度，兩組半定量分級(jí)評(píng)分顯示差異具有顯著性（P＜0.05）。這一結(jié)果提示造模停止6月后，CCl4誘導(dǎo)的肝硬化模型大鼠的肝細(xì)胞壞死，脂肪變性等病變可能通過自體肝細(xì)胞的增殖而修復(fù)，但纖維化改變不可逆，經(jīng)PBMCs移植，或單純G-CSF動(dòng)員治療后，纖維化程度明顯減輕。
　　【結(jié)論】
　　本研究揭示了肝硬化患者的PBMCs在體外能分化成肝樣細(xì)胞，在體內(nèi)可以定植于損傷的肝臟，并在其微環(huán)境下向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化。在肝硬化動(dòng)物模型上的研究結(jié)