人臍血單核細胞海馬移植治療血管性癡呆大鼠的實驗研究.pdf

1、背景與目的： 血管性癡呆(Vasculardementia,VD)是指由于腦血管疾病引起的腦組織梗塞、低灌注或出血所致的認知功能損害綜合征。目前，VD成為老年期癡呆的第二大病因，僅次于阿爾茨海默病(Alzheimerdisease,AD)。隨著人口老齡化和腦血管疾病發(fā)病率的上升，VD的發(fā)病率也逐年上升。但對于VD尚無特效治療方法。自1998年人類胚胎干細胞(embryonicstemcells,ESCs)成功分離以來，干細胞研究

2、受到了全球范圍的廣泛關注和重視，也取得了顯著的進展和巨大的成就。干細胞是指未成熟細胞，具有自我更新和分化能力，可以分化為多系統(tǒng)細胞、組織及器官[1]。干細胞技術能夠?qū)⒓毎苌筛鞣N不同類型的細胞及其組織，從而產(chǎn)生干細胞移植、組織器官再造和基因治療等全新的治療技術。 干細胞可分為ESCs和成體干細胞(adultstemcells)，其中ESCs是最有應用價值的干細胞，但由于其來源于胚胎，必然涉及倫理和道德問題[2]，因此，成體干細

3、胞應用受到了重視。成體干細胞是存在于發(fā)育成熟個體組織中的可自我更新和分化為原組織所有細胞類型的未分化細胞[3]。骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是研究最早、最為深入的一類多能干細胞，其來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，具有廣泛的分化潛能，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralneuralsystem,CNS)疾病如腦缺血及腦外傷等治療方面得到了應用[4]。人臍血含有豐富的多能干/祖細胞，具有增殖能力強、來源豐

4、富、采集方便及免疫原性低等優(yōu)點。臍血較骨髓含有更多的干細胞，而且這些干細胞更原始。提示臍血源性干細胞比骨髓源性干細胞更有治療應用價值。目前已有報道將人臍血細胞(humanumbilicalcordbloodcells,HUCBCs)用于治療CNS損傷(如腦缺血或脊髓損傷)的動物模型能夠取得較好的效果[5,6]。 本實驗首先從人臍血中分離、誘導、培養(yǎng)臍血干細胞，利用腦立體定向技術將HUCBCs移植于VD模型大鼠海馬內(nèi)，觀察治療前后

5、大鼠行為和認知功能的改善、病理結構的改變及膽堿能系統(tǒng)功能的恢復。 方法： 1.臍血的采集、分離及誘導培養(yǎng)采集足月妊娠、正常分娩產(chǎn)婦臍帶血，用淋巴細胞分層液梯度密度離心法分離出臍血單個核細胞(Humancordbloodmononuclearcells，HCMNCs)，并用神經(jīng)生長因子(NGF)和維甲酸(RA)聯(lián)合誘導培養(yǎng)。 2.HCMNCsNSC標志物的檢測用RT-PCR技術，檢測細胞培養(yǎng)前后Nestin及mus

6、ashi-1mRNA的表達變化。 3.HCMNCs的標記分別應用BrdU及DAPI兩種標記物對HCMNCs進行體外標記。通過免疫組化染色觀察并計算BrdU陽性細胞標記率。DAPI標記細胞直接用熒光顯微鏡觀察，計算標記率。 4.實驗動物分組大鼠隨機分為模型組(Modelgroup)、治療組(Treatmentgroup)和對照組(Controlgroup)，各組大鼠又分為2周(2w)、4周(4w)、8周(8w)3個時相點。

7、 5.動物模型采用兩血管阻斷法制作動物模型。治療組利用腦立體定向技術將HCMNCs(3×106個/500μl)注入大鼠右側海馬內(nèi)，應用計算機控制的穿梭箱主動回避反應(activeavoidanceresponse,AAR)檢測實驗大鼠的學習記憶能力。 6.大鼠腦組織內(nèi)的HCMNCs檢測通過BrdU及DAPI對HCMNCs進行標記，觀察標記的HCMNCs注入大鼠海馬后存活及遷移情況。 7.海馬組織中乙酰膽堿酯酶/膽

8、堿乙酰轉(zhuǎn)移酶含量檢測海馬勻漿測定移植前后乙酰膽堿酯酶活性及乙酰膽堿含量的變化。 8.病理學觀察以光學顯微鏡觀察各組大鼠腦組織病理變化。 結果 1.HCMNCs的分離和培養(yǎng) 培養(yǎng)前，HCMNCs胞體較小，呈大小均一的圓形，直徑約17μm，顏色較深，在高倍鏡下可見其不停振動。培養(yǎng)后，細胞胞體增大，大部分細胞貼壁生長，形態(tài)呈梭形，大小不等，形態(tài)類似于骨髓MSCs,但較骨髓MSCs稍小。加入NGF和RA誘導后，部

9、分細胞突起明顯變長。 2.HCMNCs中NSCs標志物mRNA的表達 分離后1h細胞中NestinmRNA含量較低，培養(yǎng)后36h逐漸升高，72h后開始降低；Musashi-1mRNA在分離后1h細胞中低表達，培養(yǎng)48h后呈高表達。 3.BrdU免疫組織化學方法分析結果 BrdU體外標記率約為90％，提示HCMNCs在體外活躍增殖。移植后，治療組大鼠腦組織發(fā)現(xiàn)大量BrdU標記的HCMNCs，提示HCMNCs

10、可以在大鼠腦內(nèi)存活。 4.DAPI熒光標記法分析結果 HCMNCs體外DAPI熒光標記率為100％。海馬注入后，熒光細胞聚集于針道。隨著時間的推移，熒光細胞向遠處轉(zhuǎn)移。說明HCMNCs可以在腦內(nèi)存活并且遷移。 5.穿梭箱測試結果 治療前，各組大鼠AAR百分比無明顯差異。模型組各時相點大鼠AAR百分比較對照組顯著降低。治療組大鼠AAR百分比顯著低于對照組，但高于模型組。提示HCMNCs治療對VD大鼠的行為學

11、有改善作用。 6.海馬組織乙酰膽堿酯酶/乙酰膽堿含量檢測結果 治療前，各組乙酰膽堿酯酶/乙酰膽堿含量無顯著差異。4周后，模型組大鼠海馬中Ach含量及AchE活性均較對照組低；而治療組Ach含量及AchE活性均顯著升高(P＜0.01) 7.各組大鼠腦組織病理學改變 模型組可見細胞核固縮，胞質(zhì)密度增高，線粒體腫脹，軸突水腫、變性、脫髓鞘等慢性缺血缺氧的病理改變。治療組上述改變明顯減輕。 結論

12、1.本實驗成功分離HCMNCs，誘導后部分細胞表現(xiàn)出NSCs的形態(tài)特征，并檢測到NSCs標志物Nestin和musashi-1mRNA的表達，提示HCMNCs中存在具有NSCs特性的細胞群。這一結果為HCMNCs治療VD大鼠提供了理論依據(jù)。 2.BrdU免疫組化及DAPI免疫熒光法檢測證實，HCMNCs能夠在移植鼠腦的海馬內(nèi)存活并遷移。 3.行為學檢測結果表明HCMNCs治療后，VD大鼠的穿梭箱AAR比例顯著高于對照組。

13、提示HCMNCs海馬移植能夠顯著改善VD大鼠的學習記憶能力。 4.VD大鼠造模后腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)功能全面下降；而細胞移植后，AchE活性及Ach含量均明顯升高。說明臍血干細胞移植能明顯改善膽堿能系統(tǒng)的功能，調(diào)節(jié)腦內(nèi)生理代謝，從而達到改善記憶治療VD的目的。 神經(jīng)干細胞(neuralstemcells，NSCs)移植已被用來研究和促進神經(jīng)系統(tǒng)疾病的修復，但NSCs的來源十分有限。間質(zhì)干細胞(mesenchymalstemce

14、lls,MSCs)是中胚層發(fā)育的早期細胞，有多向分化潛能，可以通過骨髓、臍血和周圍血獲得。臍血MSCs在適宜的體內(nèi)或體外環(huán)境下，可分化為神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞，并在分化過程中表達NSCs特異性標志。另外，臍血來源豐富，采集方便，免疫排斥反應低，使臍血MSCs成為用于細胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾患的又一重要來源。 綜述臍血間質(zhì)干細胞(mesenchymalstemcells,MSCs)經(jīng)誘導分化為神經(jīng)干細胞(neuralstemcells

15、，NSCs)的方法，及其用于細胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralneuralsystem,CNS)疾病的研究進展。 資料來源：應用計算機檢索Medline1994-01/2004-08以及NCBI1994-01/2004-08期間的關于臍血MSCs與NSCs的文章，檢索詞“humanumbilicalcordbloodmesenchymalstemcells，neuralstemcells",并限定語言種類為English。

16、同時計算機檢索中文數(shù)據(jù)庫CNKI1994-01/2004-08期間的相關文章，檢索詞“臍血，間質(zhì)干細胞，神經(jīng)干細胞”。 資料選擇：對資料進行初審，選取有關臍血中分離MSCs，誘導分化為神經(jīng)細胞的研究，及臍血細胞移植治療CNS疾病方面的論著及綜述。 資料提煉：共收集到關于臍血MSCs誘導分化為神經(jīng)細胞及用于細胞移植治療CNS疾病的文獻。其中中文3篇，英文34篇。 資料綜合：綜合37篇提煉的研究資料，綜述臍血MSCs

17、的分離、培養(yǎng)及誘導為神經(jīng)細胞的方法研究，評估臍血源性NSCs用于移植治療CNS疾病的效果與發(fā)展前景。 結論：NSCs移植已被用來研究和促進神經(jīng)系統(tǒng)疾病的修復，但NSCs的來源十分有限。MSCs是中胚層發(fā)育的早期細胞，有多向分化潛能，可以通過骨髓、臍血和周圍血獲得。臍血MSCs在適宜的體內(nèi)或體外環(huán)境下，可分化為神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞，并在分化過程中表達NSCs特異性標志。加之臍血來源豐富，采集方便，免疫排斥反應低，使臍血MSCs成為