神經(jīng)干細(xì)胞移植治療血管性癡呆大鼠的研究.pdf

1、第一部分:大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)及慢病毒介導(dǎo)GFP轉(zhuǎn)染的實驗研究
　　目的
　　原代培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，并在體外繼續(xù)分裂增殖、穩(wěn)定傳代，慢病毒介導(dǎo)GFP轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞后，可做為移植的種子細(xì)胞，滿足細(xì)胞移植需要。
　　材料與方法
　　以健康孕15天Wistar大鼠為實驗動物，體外分離并原代培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，之后傳代培養(yǎng)，并進(jìn)行單細(xì)胞克隆實驗。免疫熒光法和免疫組化SP法對神經(jīng)干細(xì)胞分進(jìn)行鑒定，Lentivirus介導(dǎo)轉(zhuǎn)染NS

2、Cs。
　　結(jié)果
　　1.原代培養(yǎng)細(xì)胞可形成數(shù)十個細(xì)胞聚集而成的小神經(jīng)球(Neurosphere)神經(jīng)球逐漸增大，7天時神經(jīng)球已生長成為數(shù)百個細(xì)胞的大克隆，即可傳代培養(yǎng)。傳代第7天時已再次長成為數(shù)百個細(xì)胞聚集的大克隆，將細(xì)胞連續(xù)傳代，細(xì)胞的生長模式基本相同。
　　2.原代培養(yǎng)的神經(jīng)球經(jīng)分散、再擴(kuò)增得到的大量神經(jīng)球呈nestin抗原陽性;神經(jīng)球可以分化為三種細(xì)胞，免疫熒光法和免疫組化SP法檢測三種細(xì)胞分別呈NSE、CNP

3、、GFAP陽性。
　　3.慢病毒介導(dǎo)GFP轉(zhuǎn)染NSCs后，熒光顯微鏡下觀察，可見NSCs攜帶綠色熒光。
　　結(jié)論
　　1.從大鼠胚胎（孕15天）腦組織中分離的神經(jīng)干細(xì)胞在體外可繼續(xù)分裂增殖、穩(wěn)定傳代，可滿足細(xì)胞移植需要。
　　2.慢病毒介導(dǎo)GFP轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞，標(biāo)記后的神經(jīng)干細(xì)胞做為移植的種子細(xì)胞，便于在動物體內(nèi)進(jìn)行跟蹤研究。
　　第二部分:NSCs移植治療大鼠血管性癡呆
　　目的
　　將慢病毒

4、介導(dǎo)GFP標(biāo)記的NSCs通過海馬立體定向注射的方法移植到血管性癡呆模型大鼠，使海馬周圍的NSCs數(shù)量增加，用Morris水迷宮檢測系統(tǒng)對實驗大鼠作定位航行試驗和空間探索實驗測試，檢測大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的改變，觀察NSCs移植的治療效果。
　　材料與方法
　　月齡12～15個月健康成年Wistar大鼠，體重300～400g，用來制備血管性癡呆2VO模型;傳代至第6代的Wistar大鼠神經(jīng)干細(xì)胞，GFP標(biāo)記后于2VO模型造模35

5、天后海馬立體定向注射移植，對假手術(shù)組、對照組、NSCs移植組海馬組織切片做尼氏染色，觀察病理學(xué)改變;在缺血4、9、13、17周（移植前和移植后4周、8周、12周）時對移植前后各組大鼠行Morris水迷宮測試，對定位航行實驗和空間探索實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果
　　1.神經(jīng)干細(xì)胞移植1周后,大鼠海馬區(qū)冰凍切片顯示有綠色熒光存在，證明神經(jīng)干細(xì)胞可在海馬區(qū)域存活、增殖。
　　2.缺血4周時（移植前），NSCs移植組與對

6、照組大鼠各項指標(biāo)均無顯著性差異，但二者與假手術(shù)組相比均有顯著性差異。缺血9、13、17周（移植后4周、8周、12周）時，NSCs移植組大鼠逃避潛伏期較對照組均明顯縮短(P＜0.05)，但與假手術(shù)組相比仍明顯延長;NSCs移植組穿越平臺區(qū)次數(shù)較對照組也明顯增加(P＜0.05)，與假手術(shù)組相比仍明顯減少(P＜0.01);NSCs移植組大鼠平臺所在象限停留的時間百分比較對照組明顯增加(P＜0.05，移植后12周除外)，但與假手術(shù)組相比仍明顯減

7、少(P＜0.05)。
　　3.NSCs移植組尼氏染色顯示神經(jīng)元丟失、變性情況較對照組有明顯改善，神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)較完整，胞漿內(nèi)尼氏小體相對較豐富。
　　結(jié)論
　　神經(jīng)干細(xì)胞移植到VaD大鼠模型中后，可在一定程度上改善VaD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。
　　第三部分:Notch通路在神經(jīng)干細(xì)胞移植治療血管性癡呆大鼠中的作用研究
　　目的
　　檢測神經(jīng)干細(xì)胞移植對VaD大鼠海馬區(qū)Notch1及Hes1表達(dá)的動態(tài)改變，

8、研究神經(jīng)干細(xì)胞移植對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善與海馬區(qū)Notch1、Hes1表達(dá)的變化是否相關(guān)，探討Notch信號通路是否參與了神經(jīng)干細(xì)胞移植對血管性癡呆大鼠模型的治療。
　　材料與方法
　　月齡12～15個月健康成年Wistar大鼠，體重300～400g，用來制備血管性癡呆2VO模型;傳代至第6代的wistar大鼠神經(jīng)干細(xì)胞球，GFP轉(zhuǎn)染標(biāo)記后做為移植的種子細(xì)胞，于2VO模型造模35天后海馬立體定向注射移植，對假手術(shù)組、對照組

9、、NSCs移植組腦組織海馬區(qū)蛋白樣品進(jìn)行Westernblot檢測。
　　結(jié)果
　　在缺血9周、13周、17周（移植后4周、8周、12周）的Westernblot檢測檢測均提示NSCs移植組Notch1和Hes1表達(dá)水平較對照組高，有顯著性差異(P＜0.05)，但與假手術(shù)組相比仍明顯較低(P＜0.05);NSCs移植組3個時間點的Notch1和Hes1表達(dá)逐漸下降，呈時間依賴性。
　　結(jié)論
　　移植的NSCs激活

10、了Notch1-Hes1通路，該通路可能參與NSCs移植對血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的修復(fù)。
　　第四部分:神經(jīng)干細(xì)胞移植治療對血管性癡呆大鼠突觸可塑性的影響
　　目的
　　研究神經(jīng)干細(xì)胞移植治療血管性癡呆大鼠的過程中是否存在樹突與樹突棘的形態(tài)和結(jié)構(gòu)改變，血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善是否與樹突和樹突棘的形態(tài)和結(jié)構(gòu)改變相關(guān)。
　　材料與方法
　　月齡12～15個月健康成年Wistar大鼠，體重300～40

11、0g，用來制備血管性癡呆2VO模型;傳代至第6代的wistar大鼠神經(jīng)干細(xì)胞球，GFP轉(zhuǎn)染標(biāo)記后做為移植的種子細(xì)胞，于2VO模型造模35天后海馬立體定向注射移植，對假手術(shù)組、對照組、NSCs移植組腦組織海馬CA1區(qū)樹突的分支及樹突棘密度進(jìn)行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果
　　血管性癡呆對照組及NSCs移植組樹突分支數(shù)目與假手術(shù)組相比均明顯減少，有顯著性差異，隨時間延長下降趨勢不明顯;NSCs移植組樹突分支數(shù)目與血管性癡呆模型對照組相比