骨髓間充質干細胞移植對血管性癡呆大鼠行為學及鈣通道影響的研究.pdf

1、目的: 通過復制血管性癡呆（Vascular Dementia, VaD）大鼠模型并對其進行行為學和鈣通道相關信號通路檢測，探討VaD大鼠鈣通道信號通路的改變，分析其改變引起記憶認知障礙的可能機制。同時進一步探討骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cells, BMSCs）移植對VaD大鼠認知功能的改善和鈣通道以及與鈣通道相關信號通路的影響機制，為BMSCs的臨床應用提供適用性資料。
　　方法: （1）通

2、過貼壁篩選的方法分離、培養(yǎng)BMSCs，至第五代細胞純化后，用流式細胞儀對所培養(yǎng)BMSCs進行流式表面抗原鑒定，成纖維生長因子（basic fibroblast growth factorbfic，bFGF）和丁羥基茴香醚（Beta Hydroxy Acid，BHA）誘導BMSCs分化為神經元細胞，并對誘導后的細胞，進行神經巢蛋白(Nestin)、神經元特異性烯醇化酶(Neuron speeific enolase，NSE)表達的免疫組化

3、鑒定。誘導后的BMSCs于移植前24h在其培養(yǎng)液中加入濃度為10μmol/L的標記物5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine，BrdU)，離心收集標記后的BMSCs，備用。（2）提前進行大鼠水迷宮智力篩查，大鼠隨機分為對照組和模型組，模型組用改良Pulsinelli’s四血管阻斷法復制VaD模型，對照組只分離椎動脈和頸總動脈，不進行椎動脈凝閉和頸總動脈的夾閉。30天后篩選模型組中認知功能障礙的大鼠再分為模型對照

4、組和干細胞治療組。干細胞治療組將誘導后被BrdU標記的BMSCs細胞懸液通過腦立體定位儀注射到大鼠側腦室，對照組和模型對照組注射等量培養(yǎng)基。細胞移植30天后進行水迷宮行為學測試，各組大鼠斷頭取腦，制備石蠟切片，蘇木素-伊紅（Hematoxylin-eosin，HE）染色觀察大鼠大腦海馬區(qū)病理變化。（3）免疫組化染色方法檢測移植的細胞在大鼠腦組織的表達情況；檢測血漿和海馬組織一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase, NO

5、S）活性和NO含量；提取血細胞和海馬組織總RNA，Real-time PCR方法測定鈣調蛋白（Calmodulin，CaM）、鈣調蛋白依賴性激酶Ⅱ（Calcium/calmodulin-dependent protein kinaseII,CaMKII）和NOS mRNA表達含量；提取海馬組織總蛋白，BCA法進行蛋白定量，用蛋白免疫印跡(Western Blotting)法檢測鈣調蛋白依賴性激酶（CaMKⅡ）和與鈣通道相關的NOS蛋白酶

6、的表達情況。比較對照組、模型對照組組和干細胞治療組中各項指標，并對各組的含量做出差異性統(tǒng)計學分析。
　　結果: （1）通過貼壁篩選法分離培養(yǎng)BMSCs，體外傳代擴增后，流式細胞儀檢測第五代BMSCs表達粘附分子CD90陽性率99.4％，CD29陽性率96.8%，CD44陽性率99.6%，CD45陽性率3.7%。誘導后的BMSCs可表達NSE和Nestin。（2）模型對照組組和干細胞治療組與對照組相比，模型對照組組和干細胞治療組大鼠

7、平均逃避潛伏期明顯長于對照組，撤去平臺后，模型對照組和干細胞治療組第1次穿越平臺所用時間延長，穿越站臺次數(shù)明顯減少，存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。干細胞治療組較模型對照組逃避潛伏期縮短（P＜0.05），第1次穿越平臺時間縮短，穿越平臺次數(shù)增加，差異有統(tǒng)計學意義。（3）干細胞治療組在移植后30天大鼠腦組織雙側半球切片中可見BrdU染色陽性細胞分布，BrdU陽性反應物呈棕褐色、顆粒狀或彌漫性分布，位于細胞核內。（4）通過對比分析對照組、模

8、型對照組和干細胞治療組與鈣通道及鈣信號相關指標的表達差異，結果顯示模型對照組上述酶的活性、mRNA和蛋白表達水平較對照組高（P＜0.05），而干細胞治療組與模型對照組相比，CaMKⅡ、CaM、NOS和NO表達降低（P＜0.05）。
　　結論: （1）BMSCs在體外經bFGF/BHA誘導可分化為神經元樣細胞，且可表達Nestin和NSE。（2）VaD模型大鼠與鈣通道主要相關的NOS和CaMKII信號表達增高，提示鈣超載參與到了Va