骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植和干細(xì)胞動(dòng)員對(duì)血管損傷修復(fù)及功能影響的對(duì)比研究.pdf

1、研究背景： 由于血管內(nèi)皮損傷、功能障礙而導(dǎo)致的平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)膜增殖造成的管腔狹窄，進(jìn)而引起臟器缺血所導(dǎo)致的疾病是目前人群致死、致殘的首要因素。如何盡可能恢復(fù)損傷血管內(nèi)皮的結(jié)構(gòu)和功能，阻斷或延緩內(nèi)皮損傷后病理過(guò)程的演變，是治療上述疾病亟待解決的難題。 作為治療臟器缺血性疾病的重要手段之一，血管成形術(shù)(angioplasty)或稱再血管化(revascularization)治療以其創(chuàng)傷小、療效確切、恢復(fù)迅速日顯重要。

2、其根本手段就是通過(guò)擴(kuò)張擠壓或移除血管腔內(nèi)的增生組織，達(dá)到通暢管腔、開(kāi)放血流的目的。這樣，作為血管腔內(nèi)的操作，再血管化治療不可避免的要損傷血管內(nèi)皮，這有可能導(dǎo)致術(shù)后再狹窄(restenosis RS)，是血管成形術(shù)后期主要的并發(fā)癥，嚴(yán)重影響再血管化治療的效果，即使在支架時(shí)代，其發(fā)生率仍高達(dá)12％-32％。目前RS的機(jī)制尚未完全清楚，但有研究發(fā)現(xiàn)與球囊擴(kuò)張時(shí)破壞了血管的內(nèi)皮屏障，暴露血管基質(zhì)，導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞(smooth muscle ce

3、lls SMCs)活化、表型轉(zhuǎn)化、遷移、增殖，并引起細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix ECM)代謝失衡，從而引起血管內(nèi)膜持續(xù)增厚有關(guān)。現(xiàn)有的防止RS方法是使用藥物洗脫支架或血管內(nèi)放射治療，雖有較好療效，但在抑制VSMCs和ECM增生的同時(shí)也抑制了血管內(nèi)皮的修復(fù)，有形成遲發(fā)血栓的危險(xiǎn)。如何在再血管化治療時(shí)保護(hù)內(nèi)皮，盡量減少內(nèi)皮損傷，加快靶血管再內(nèi)皮化，從而降低RS率是發(fā)展血管成形術(shù)，治療臟器缺血性疾病的重大課題，而當(dāng)前

4、有關(guān)干細(xì)胞的研究無(wú)疑為我們帶來(lái)了新的曙光，將有可能開(kāi)創(chuàng)治療缺血性疾病及臟器功能障礙的一條嶄新之路。 干細(xì)胞(stem cell)是一類具有多向分化潛能和自我復(fù)制功能的早期未分化細(xì)胞，在特定條件下可以分化成不同的功能細(xì)胞，形成多種組織和器官，即具有“可塑性”(Plasticity)。根據(jù)在個(gè)體發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)的先后次序不同，干細(xì)胞分為胚胎干細(xì)胞(embroynic stem cells，ESCs)和成體干細(xì)胞(adult stem

5、 cells，ASCs)。ESCs被稱為全能干細(xì)胞，可向全身所有組織分化，特定條件下甚至可以發(fā)育成完整的個(gè)體。但ESCs移植存在供體來(lái)源受限、免疫排斥反應(yīng)和倫理學(xué)糾紛等缺點(diǎn)，以及其安全性尤其是長(zhǎng)期安全性和有效性仍未得到完全確證，使其研究和應(yīng)用受到了很大限制。ASCs是出生后個(gè)體中繼續(xù)存在的未分化細(xì)胞，具有橫向分化(Transdifferentiaton)能力，在一定條件下能分化成它來(lái)源組織以外的其它組織系統(tǒng)的細(xì)胞，即跨系統(tǒng)甚至跨胚層分化

6、，是成年個(gè)體組織和器官修復(fù)再生的基礎(chǔ)。其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stemcells BMMSCs)近年來(lái)研究的最為深入。BMMSCs來(lái)自骨髓基質(zhì)，也稱骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(marrow stromal cells MSCs)，是骨髓中除造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells HSCs)外的另一群早期前體細(xì)胞，具有典型的多向分化潛能，在一定條件下能向骨、神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、肝細(xì)胞

7、、心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等分化。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和早期臨床試驗(yàn)均證明經(jīng)不同的途徑移植的BMMSCs，可以通過(guò)分化為心肌細(xì)胞、增加微血管生成等作用改善缺血壞死心肌的功能，改善心梗后心臟重塑。BMMSCs采集及分離方法簡(jiǎn)便、成熟，可以從骨髓中反復(fù)抽取，數(shù)量充足，免疫原性低，用于自體移植治療實(shí)用可行，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)BMMSCs具有獨(dú)特的免疫耐受性，它們有可能成為“萬(wàn)能供體”，這對(duì)于臨床應(yīng)用意義深遠(yuǎn)。加上其強(qiáng)大的增殖能力和其“微環(huán)境誘導(dǎo)分

8、化(milieuinflunenced differenciation)”的能力，BMMSCs有可能成為細(xì)胞移植修復(fù)損傷臟器的最佳種子細(xì)胞來(lái)源之一。大量的研究證實(shí)BMMSCs移植可以改善心肌梗死后的心臟功能，然而BMMSCs對(duì)于損傷血管的修復(fù)有無(wú)作用極少報(bào)道。 新近許多研究證實(shí)在骨髓、外周血、臍血中存在著內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，在損傷信號(hào)的刺激下能被招募到血管損傷局部，對(duì)成

9、體血管損傷后的內(nèi)皮修復(fù)起重要作用。EPCs是一種多能干細(xì)胞，既能粘附、增殖并分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)修復(fù)損傷的血管，又能以一種嶄新的方式即血管發(fā)生(vasculogenesis)的方式來(lái)分化形成新的成體血管結(jié)構(gòu)。與BMMSCs不同，EPCs起源于胚胎期胚外中胚層的血島，故EPCs與造血細(xì)胞系同源。個(gè)體出生后，EPCs定居于骨髓，它可以從骨髓釋放，并在外周循環(huán)中運(yùn)行，在損傷信號(hào)的誘導(dǎo)下遷移到損傷局部，分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞，參與血管新生和修復(fù)。除

10、了損傷信號(hào)外，尚有多種手段可以增加外周血中EPCs的數(shù)量，包括運(yùn)動(dòng)、藥物刺激等。目前確切證實(shí)可以增加成體外周血EPCs的藥物有干細(xì)胞因子、粒細(xì)胞集落刺激因子、他汀類、雌激素等。作為外源性干細(xì)胞動(dòng)員劑，粒細(xì)胞集落刺激因子和他汀類能刺激骨髓中EPCs進(jìn)入外周血，加速損傷血管的再內(nèi)皮化，降低血管壁的炎性反應(yīng)，抑制新生內(nèi)膜的增生，從而抑制血管損傷后的再狹窄。這樣，作為細(xì)胞療法的兩種主要方式，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植和干細(xì)胞動(dòng)員實(shí)際上是使用了兩種不同

11、類型的干細(xì)胞，此兩類細(xì)胞對(duì)血管損傷后的修復(fù)效果有無(wú)差異尚不清楚。另外，血管損傷后需要修復(fù)的不僅僅是血管的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，更重要的是其功能的修復(fù)，有關(guān)于此的研究極少，兩類干細(xì)胞對(duì)損傷后血管功能改善的效果對(duì)比更未見(jiàn)報(bào)道。本研究從形態(tài)和功能兩方面對(duì)比了兩種干細(xì)胞療法對(duì)損傷血管的修復(fù)作用，為臨床對(duì)于血管損傷，保護(hù)血管內(nèi)皮，減輕PCI術(shù)后RS治療方案的選擇提供思路。 本研究分三部分。 第一部分：大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型構(gòu)建方法的改良及超

12、聲多普勒評(píng)價(jià)的研究 研究目的：改良球囊損傷大鼠頸總動(dòng)脈的手術(shù)方法，建立穩(wěn)定的大鼠頸總動(dòng)脈球囊機(jī)械損傷后狹窄的模型，從損傷血管組織形態(tài)學(xué)方面的動(dòng)態(tài)變化來(lái)觀察機(jī)械損傷后的大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)皮修復(fù)和內(nèi)膜增生的影響，評(píng)價(jià)無(wú)創(chuàng)性的超聲多普勒技術(shù)動(dòng)態(tài)觀察大鼠頸總動(dòng)脈球囊損傷后血流動(dòng)力學(xué)變化的特點(diǎn)。 研究結(jié)論：改進(jìn)器材和方法能建立穩(wěn)定的大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型，造成損傷血管內(nèi)皮剝脫、管腔進(jìn)行性狹窄。動(dòng)物死亡率低，成模率高，可以滿足研究血管損

13、傷反應(yīng)和再狹窄的需要。另外，對(duì)于此方法建模的大鼠，超聲和多普勒動(dòng)態(tài)無(wú)創(chuàng)追蹤觀察時(shí)應(yīng)注意，其血流動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)不同于血管局限狹窄的模型，推測(cè)與血管損傷彌漫，損傷側(cè)血管整體灌流不好有關(guān)。第二部分：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植和干細(xì)胞動(dòng)員對(duì)大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后再內(nèi)皮化和內(nèi)膜增生過(guò)程的影響 研究目的：通過(guò)大鼠頸總動(dòng)脈球囊損傷后狹窄模型，研究經(jīng)靜脈移植BMMSCs對(duì)大鼠頸總動(dòng)脈球囊損傷后再內(nèi)皮化和內(nèi)膜增生過(guò)程的影響，并與重組人粒細(xì)胞集落刺激因子和阿

14、托伐他汀的干細(xì)胞動(dòng)員作用相比較，觀察使用2種不同干細(xì)胞的效果有無(wú)差別，探討其可能機(jī)制。 研究結(jié)論及意義：無(wú)論是BMMSCs移植還是干細(xì)胞動(dòng)員劑rhG-CSF、阿托伐他汀均可以促進(jìn)大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后的血管內(nèi)皮再生，減少新生內(nèi)膜的形成，提示BMMSCs植和干細(xì)胞動(dòng)員對(duì)球囊損傷后的正常內(nèi)皮功能和結(jié)構(gòu)的重新建立，抑制新生內(nèi)膜形成均具有有益作用，有可能成為治療PCI術(shù)后再狹窄和各種以血管內(nèi)皮損傷為共同病理生理基礎(chǔ)疾病的新手段。BMMSC

15、s移植與rhG-CSF、阿托伐他汀動(dòng)員相比較，BMMSCs移植對(duì)損傷血管再內(nèi)皮化，減輕內(nèi)膜增生的作用最強(qiáng)；雖然rhG—CSF動(dòng)員對(duì)損傷血管促內(nèi)皮再生作用強(qiáng)于阿托伐他汀，但兩者對(duì)內(nèi)膜增生的抑制作用相似，提示有別的機(jī)制參與損傷后血管重構(gòu)。 第三部分：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植和干細(xì)胞動(dòng)員對(duì)大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后血管功能變化的影響 研究目的：通過(guò)大鼠頸總動(dòng)脈球囊損傷狹窄模型，研究干細(xì)胞動(dòng)員劑rhG-CSF和阿托伐他汀對(duì)大鼠頸總動(dòng)脈球囊

16、損傷后血管舒縮功能及對(duì)血管細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)代謝的影響，與BMM SCs靜脈移植相比較，觀察使用2種不同的有干細(xì)胞的效果有無(wú)差別，探討其可能機(jī)制。 研究結(jié)論及意義：無(wú)論BMMSCs移植還是干細(xì)胞動(dòng)員，對(duì)于損傷血管功能改善均有意義。對(duì)于損傷血管舒縮因子的調(diào)節(jié)，BMMSCs移植效果優(yōu)于干細(xì)胞動(dòng)員，rhG-CSF和阿托伐他汀兩種動(dòng)員劑相比則rhG—CSF較好；對(duì)于影響基質(zhì)代謝的重要酶MMP-2和TIMP-2的調(diào)節(jié)，阿托伐他汀效果優(yōu)于