抑郁癥外周血單核細胞中差異性表達microRNA的臨床和實驗研究.pdf

1、抑郁癥是一種最為常見的精神疾病，在世界范圍內(nèi)，其終生患病率約為5.2％～19％。抑郁癥共病心血管疾病、心肌梗塞、糖尿病、物質(zhì)成癮等疾病的機會明顯高于正常人;此外，抑郁癥病人有著很高的自殺率，嚴重威脅人們的心身健康。此病不僅嚴重影響患者的生活質(zhì)量，還會對其社會、職業(yè)功能造成明顯影響，使社會背負沉重的經(jīng)濟負擔，甚至可成為社會不安定因素。盡管經(jīng)過數(shù)十年的努力，對于精神疾病包括抑郁癥的認識有了很大的提高，但是對于抑郁癥的分子生物學、細胞生物機制

2、尚不清楚。
　　已有研究表明，在抑郁癥的早期明確診斷并及時給予有效治療，可以顯著改善患者的心理、生理、社會功能以及工作效率，并大大減少治療費用。然而，目前臨床上對于抑郁癥的診斷仍是依靠臨床醫(yī)生對病人多種癥狀的主觀評估，缺乏有效的客觀診斷“金標準”，因而在臨床上誤診、誤治在所難免。因此，臨床上迫切需要找到一種具有高度敏感性和特異性的生物標志物，來幫助臨床醫(yī)生對抑郁癥做出早期診斷和早期干預。以往學者們對神經(jīng)生長因子、細胞因子、內(nèi)分泌分

3、子、代謝產(chǎn)物以及腦影像學等因素進行了大量研究，考察其作為生物標志物的可行性，但是都未能達到生物標志物所要求的特異度和敏感度。
　　microRNA是一類單鏈非編碼小分子RNA，長約21-22個核苷酸，通過部分性或完全性地與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)互補配對，阻止其翻譯或使其降解，從而起到基因轉錄后調(diào)節(jié)的作用。據(jù)研究，約有50％的蛋白質(zhì)編碼基因受到miRNA的精確調(diào)控，并且多個miRNA分子可以共同調(diào)節(jié)一個基因的表達，一

4、個miRNA分子亦可調(diào)控數(shù)百、上千個基因的表達，使得miRNA成為調(diào)控基因表達和信號通路網(wǎng)絡的關鍵節(jié)點。在大腦的發(fā)育、神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)元成熟及突觸形成過程中，miRNA都起著關鍵的調(diào)控作用;在精神疾病的發(fā)生、發(fā)展中，miRNA亦起重要作用，其表達水平與抗精神病藥物的療效有相關性。已有研究表明miRNA通過多種途徑參與了抑郁癥發(fā)病機制:1.miRNA的單核苷酸多態(tài)性(SNP)與抑郁癥之間存在顯著的相關性;2.miRNA通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元的發(fā)生影

5、響抑郁癥的發(fā)生和進展;3.miRNA參與神經(jīng)末稍突觸可塑性機制而影響抑郁癥的發(fā)生和進展;4.應激是抑郁癥發(fā)生的一個重要危險因素，而急、慢性應激會改變動物模型腦內(nèi)miRNA的表達;5.腦源性神經(jīng)生長因子(BDNF)與抑郁癥關系密切。有研究發(fā)現(xiàn)BDNF可調(diào)節(jié)miR-132的表達，進而引起神經(jīng)突形成增加及形成樹枝狀形態(tài);6.抗抑郁藥物可影響miRNA表達。
　　作為生物標志物，必須有性質(zhì)穩(wěn)定、重復性好、便于采集和測量等特性。而外周血mi

6、RNA正好具備這些特征。其理化性質(zhì)穩(wěn)定，能夠?qū)购颂呛怂崦傅慕到?，由PCR定量檢驗精度高且穩(wěn)定，其表達有組織特異性和時序性，而且采集方便、無創(chuàng)，費用低廉，便于重復檢測動態(tài)觀察其表達水平。更為重要的是，外周血白細胞與腦組織之間可能存在著相同的miRNA表達模式;此外，外周血淋巴細胞中miRNA的表達譜與其臨床癥狀之間存在密切的聯(lián)系，提示外周血淋巴細胞可能反映腦細胞的生理病理過程。上述種種特性啟發(fā)設想，外周血miRNA是否可以作為抑郁癥的生

7、物標志物呢？檢索近年來的文獻，尚未發(fā)現(xiàn)在抑郁癥領域有類似的研究報道。
　　基于以上研究背景，設計如下課題來尋找、驗證可以作為抑郁癥生物標志物的外周血miRNA，并對相關miRNA在抑郁癥病理機制中所起的作用作出探討。課題分為下述四個部分。
　　第一部分:抑郁癥外周血單核細胞中差異性表達miRNA的篩選及驗證
　　實驗方法:采用Affymetrix miRNA3.0芯片對抑郁癥和對照者（各3例）的外周血miRNA樣本進行

8、初步篩查，篩選出兩組間差異性表達的miRNA。然后選擇其中10個差異性表達的miRNA在91例抑郁癥和46例對照者的較大樣本中用qRT-PCR方法進行驗證。最后對經(jīng)過驗證的顯著差異性表達的miRNA進行ROC曲線分析。
　　結果:
　　1.通過miRNA芯片分析，篩選出26個差異性表達的miRNA。其中21個miRNA表達上調(diào)，5個miRNA表達下調(diào);
　　2.選擇其中10個miRNA在擴大樣本中采用qRT-PCR方法

9、進行驗證，發(fā)現(xiàn)miR-1972、miR-26b、miR-4485、miR-4498、miR-4743等5個miRNA的表達差異性具有顯著性。ROC曲線分析提示，上述5個miRNA作為一個整體，其聯(lián)合ROC曲線的AUC為0.6361，敏感值為54.35％，特異值為79.01％。
　　第二部分:抗抑郁藥物干預對PBMC中miRNA的影響
　　實驗方法:采用5-羥色胺再攝取抑制劑（單藥或聯(lián)合用藥）對入組的27例抑郁癥病人實行藥物干

10、預。在藥物干預前及干預3周后，使用漢密爾頓抑郁量表(HAMD)24項版對病人的臨床癥狀進行評估;同時抽取外周血，分離單核細胞后以qRT-PCR方法檢測miRNA的表達量。
　　結果:
　　1.抗抑郁藥物干預3周后，HAMD各項分數(shù)除“日夜變化”因子外，總分及其它因子分均較治療前顯著下降;
　　2.在抗抑郁藥物干預3周后，患者PBMC中miR-26b、miR-1972、miR-4485、miR-4498、miR-4743

11、等5個miRNA的相對表達量均較治療前顯著上升，提示治療后各miRNA的表達水平均較治療前顯著下降;
　　3.將治療前后miRNA的△CT值之差(△△CT)取2的負對數(shù)，即2-△△CT與HAMD各分值之差（△值）作spearman相關分析，結果顯示，miR-26b的2-△△CT值與△HAMD總分、△焦慮/軀體化因子分、△認知障礙因子分呈顯著正相關;miR-1972的2-△△CT值與△HAMD總分、△認知障礙因子分呈顯著正相關;mi

12、R-4743的2-△△CT值與△認知障礙因子分呈顯著正相關。
　　第三部分:抑郁癥PBMC中差異性表達的miRNA的生物信息學分析
　　實驗方法:采用TargetScan、miRDB、DIANA-microT-CDS等3個在線軟件分別對miR-26b、miR-1972、miR-4485、miR-4498、miR-4743等5個miRNA的靶基因做出預測，取3個軟件的預測結果的交集，作為miRNA的靶基因。繼而采用FunNet

13、軟件對5個miRNA的靶基因的合集進行了Gene Ontology功能注釋和KEGG信號通路(Pathway)富集分析。
　　結果:
　　1.miR-26b、miR-1972、miR-4485、miR-4498、miR-4743的靶基因涉及廣泛的GO生物學過程，包括多項與中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關的條目;
　　2.靶基因所涉及的KEGG信號通路中許多與抑郁癥關系密切;
　　3.miR-26b、miR-1972、miR-44

14、98可能在抑郁癥的病理機制中起更加重要的作用。
　　第四部分:母嬰分離抑郁小鼠模型額葉皮層中miR-26b與mTOR信號通路的關聯(lián)研究
　　實驗方法:采用母嬰分離措施誘導小鼠抑郁模型，成年后以強迫游泳實驗和懸尾實驗來評估小鼠的抑郁行為。造模成功后，分別檢測6只母嬰分離小鼠和6只對照組小鼠額葉皮層中miR-26b的表達水平以及mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt的含量。再將miR-26b的表達水平分別與p-mTOR/mT

15、OR、p-Akt/Akt值作spearman相關分析。
　　結果:
　　1.母嬰分離組小鼠額葉皮層中p-mTOR/mTOR值和p-Akt/Akt值較對照組均顯著下降;
　　2.母嬰分離組小鼠額葉皮層中miR-26b的相對表達量較對照組顯著增高;
　　3.小鼠額葉皮層中miR-26b的相對表達量與p-mTOR/mTOR比值呈負相關。
　　結論:
　　1.抑郁癥病人PBMC中miR-26b、miR-197

16、2、miR-4485、miR-4498和miR-4743出現(xiàn)差異性表達，并且其變化水平與臨床癥狀相關，有希望作為抑郁癥的生物標志物。
　　2.生物信息學分析提示，與抑郁癥相關的多條GO生物學過程和KEGG信號通路顯著富集;miR-26b、miR-1972、miR-4498可能在抑郁癥的病理機制中起著更為重要的作用
　　3.新生期母嬰分離可引起小鼠成年后額葉皮層中miR-26b表達顯著上調(diào)、mTOR信號通路活性顯著下降，且兩者