血管鈣化過程中microRNA差異性表達(dá)譜的篩選及動(dòng)態(tài)變化研究.pdf

1、第一部分血管鈣化模型的鑒定
　　目的：
　　鑒定血管鈣化的動(dòng)物及細(xì)胞模型，為觀察血管鈣化發(fā)生發(fā)展過程中miRNA表達(dá)譜的變化提供可靠的研究模型。
　　方法：
　　1.動(dòng)物模型的鑒定：SPF級(jí)4和12周齡OPG基因敲除小鼠及野生型小鼠，摘其眼球取血樣以檢測(cè)血清中Runx2及ALP水平，處死后分離主動(dòng)脈組織，10％福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，HE染色觀察主動(dòng)脈鈣化情況，免疫組化觀察主動(dòng)脈Runx2及ALP表達(dá)情況。<

2、br>　　2.細(xì)胞模型的鑒定：應(yīng)用10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉（β-GP）處理小鼠血管平滑肌細(xì)胞（MOVAS）0、14、21及38天（0天為對(duì)照組），通過茜素紅染色觀察細(xì)胞鈣化情況。
　　結(jié)果：
　　1.動(dòng)物模型
　　1.1 HE染色：4和12周齡野生型小鼠及4周齡OPG基因敲除（OPG-/-）小鼠的主動(dòng)脈均未見鈣化現(xiàn)象，而12周齡OPG-/-小鼠主動(dòng)脈則出現(xiàn)明顯的病理性鈣化。
　　1.2免疫組化：12周齡O

3、PG-/-小鼠主動(dòng)脈組織中ALP及RUNX2均呈高表達(dá)，尤其是高表達(dá)與鈣化斑塊區(qū)域。
　　1.3 ELISA檢測(cè)：4和12周齡OPG-/-小鼠血清中ALP及RUNX2水平均明顯高于同周齡的野生型小鼠（P<0.05）。
　　2.細(xì)胞模型
　　小鼠血管平滑肌細(xì)胞（MOVAS）在鈣化培養(yǎng)基誘導(dǎo)21天時(shí)出現(xiàn)較為明顯的鈣化現(xiàn)象，38天則呈現(xiàn)多發(fā)性散在鈣化結(jié)節(jié)。
　　結(jié)論：
　　1．4周齡OPG-/-小鼠血清中ALP及

4、RUNX2水平明顯升高，但其主動(dòng)脈未見鈣化；12周齡OPG-/-小鼠主動(dòng)脈出現(xiàn)明顯的病理性鈣化，且同時(shí)伴有血清中及主動(dòng)脈組織中ALP及RUNX2水平異常升高。
　　2.小鼠血管平滑肌細(xì)胞（MOVAS）在β-甘油磷酸鈉處理21天時(shí)可出現(xiàn)明顯的鈣化，成功建立了血管鈣化細(xì)胞模型。
　　第二部分血管鈣化過程中microRNA表達(dá)譜的動(dòng)態(tài)變化
　　目的：
　　應(yīng)用miRNA芯片技術(shù)，篩選血管鈣化過程中差異性表達(dá)的miRNA

5、及觀察血管鈣化發(fā)生發(fā)展過程中miRNA表達(dá)譜的動(dòng)態(tài)變化，旨在為進(jìn)一步確認(rèn)調(diào)控血管鈣化的關(guān)鍵miRNA奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.動(dòng)物模型：病理學(xué)鑒定的4周齡OPG-/-小鼠（無主動(dòng)脈鈣化）及12周齡OPG-/-小鼠（明顯主動(dòng)脈鈣化）的主動(dòng)脈組織，及相應(yīng)周齡的野生型小鼠主動(dòng)脈組織，分別提取總RNA，應(yīng)用芯片技術(shù)檢測(cè)各樣本的miRNA表達(dá)譜，并對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行比值及聚類分析等。
　　2.細(xì)胞模型：β-甘油磷酸鈉處理0天（

6、對(duì)照組）及21天（明顯鈣化組）的MOVAS細(xì)胞，分別提取總RNA，應(yīng)用芯片技術(shù)檢測(cè)各樣本的miRNA表達(dá)譜，并對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行比值及聚類分析等。
　　結(jié)果：
　　1.動(dòng)物模型miRNA表達(dá)譜
　　1.14周齡動(dòng)物：與野生型小鼠相比，OPG-/-小鼠主動(dòng)脈組織中共有370個(gè)差異性表達(dá)（倍數(shù)改變>1.5倍）的miRNA，其中上調(diào)的有 miR-125b-5p、miR-126-3p等162個(gè)，下調(diào)的有 miR-320、miR-2

7、861等208個(gè)。其中56個(gè)有顯著差異性（P<0.05），miR-139-5p等33個(gè)表達(dá)上調(diào)，miR-18a-5p等23個(gè)表達(dá)下調(diào)。
　　1.212周齡動(dòng)物：與野生型小鼠相比，OPG-/-小鼠主動(dòng)脈組織中共有差異性表達(dá)的miRNA有101個(gè)，上調(diào)的有74個(gè)，下調(diào)的有27個(gè)。其中16個(gè)顯著差異性表達(dá)的miRNAs（P<0.05），高表達(dá)的有miR-425-5p、miR-125b-5p等8個(gè)，低表達(dá)的有miR-29a-5p、miR-

8、187-3p等8個(gè)。
　　2.細(xì)胞模型miRNA表達(dá)譜
　　與對(duì)照組（誘導(dǎo)0天）相比，誘導(dǎo)21天出現(xiàn)明顯鈣化的細(xì)胞組有92個(gè)差異性表達(dá)的miRNAs（倍數(shù)改變>1.5倍），其中 miR-30a-5p等57個(gè)表達(dá)上調(diào)，miR-29a-5p等35個(gè)表達(dá)下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　通過芯片技術(shù)獲得了血管鈣化過程中不同階段的差異性表達(dá)的miRNA譜，首次在一定程度上揭示了miR-125b-5p等miRNA族在鈣化發(fā)生發(fā)展中的