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文檔簡介
1、目的:
檢測人腰椎間盤髓核細胞microRNA(miRNA)表達譜,篩選退變髓核細胞與正常髓核細胞差異性表達的miRNA,預測差異性表達miRNA的靶基因及信號通路;對顯著性差異表達的miR-494和miR-513a-5p在人退變腰椎間盤組織中進行驗證。為miRNA在人椎間盤退變發(fā)病機制中作用的研究提供實驗基礎。
方法:
1.分別獲取腰椎退行性病患者手術取出的髓核組織3份和腰椎骨折患者髓核組織1份,分為退變
2、組和正常組。采用酶消化法從髓核組織中分離出髓核細胞,后放置培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。第一代細胞爬片至70%~80%融合時,將細胞爬片取出,對髓核細胞進行染色鑒定;提取標本總RNA,采用miRNA微陣列技術檢測兩組細胞中miRNA表達譜,篩選出差異表達的miRNAs;采用MicroCosmv5、TargetScan5.1和MICRORNA-ORG軟件預測差異性miRNAs的靶基因;將差異基因或靶基因進行Gene Ontology(GO)分析;統(tǒng)計每個
3、GO term中所包括的差異基因或靶基因個數(shù),并用Fisher精確檢驗的統(tǒng)計方法計算每個GO term中差異基因或靶基因富集的顯著性:后將得到的差異基因或靶基因進行Pathway顯著性分析,分析每個Pathway中所包含的差異基因或靶基因個數(shù),用超幾何分布的統(tǒng)計檢驗方法計算出反映Pathway中差異基因或靶基因分布富集顯著性的Pvalue,根據(jù)Pvalue大小找出與差異基因或靶基因功能顯著相關的生物通路。
2.分別獲取腰椎退行
4、性病患者手術取出的髓核組織5份和腰椎骨折患者髓核組織2份,分為退變組和正常組。手術取出標本后即刻保存于RNA保存液中,4℃保存過夜,取出后將髓核組織進行分離。首先將每個標本的一部分做病理切片、染色驗證其退變性;然后另一部分標本采用Real-time qPCR技術對miR-494和miR-513a-5p差異性表達檢測。包括RNA提取,miRNA反轉錄,實時熒光定量PCR;按照△△Ct解析法來進行實驗設計,采用染料法(SYBR、GreenⅠ
5、)進行相對定量分析。
結果:
退變及正常的髓核細胞經過酶消化法分離、培養(yǎng)后均呈典型的髓核細胞形態(tài)。通過miRNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)退變組中呈差異性上調的miRNAs有20種(miR-21*、miR-663、miR-29c*、miR-638、miR-572、miR-1225-5p、miR-513a-5p、miR-101、miR-1275、miR-10b、miR-923、miR-195、miR-575、miR-181d、mi
6、R-494、miR-765、miR-210、miR-497、miR-483-5p、miR-345)。其中,miR-513a-5p和miR-494呈顯著性高表達,Ratio值分別為2.2222和2.9485;綜合三種軟件MicroCosm v5、TargetScan5.1和MICRORNA.ORG預測得出miR-513a-5p和miR-494的靶基因分別為MKK4和JunD,此兩種靶基因均參與JNK信號通路,且兩個靶基因在此通路中均顯著上
7、調。
通過對病理切片和染色證實了退變和正常髓核組織的特點;通過Real-timeqPCR技術檢測顯示退變組中miR-513a-5p與miR-494較正常組均呈現(xiàn)明顯的高表達,差異倍數(shù)2-△△Ct值分別為47.3660±39.0525和13.5560±7.9860(P<0.05),差異具有統(tǒng)計學意義,兩種miRNA高表達的差異倍數(shù)較基因芯片篩選結果更為明顯。驗證了微陣列差異基因篩選結果的可靠性和準確性。
結論:
8、 本研究首次通過miRNA微陣列技術對人腰椎間盤髓核細胞進行了miRNA表達譜分析,篩選出退變椎間盤中差異性表達上調的miRNAs共20種,其中miR-513a-5p和miR-494呈現(xiàn)非常顯著性上調;預測出miR-513a-5p和miR-494對應的靶基因MKK4和JunD,及其可能共同參與并發(fā)揮作用的信號傳導通路JNK通路;Real-time qPCR實驗技術驗證了miR-513a-5p和miR-494在退變髓核組織中的同樣呈現(xiàn)顯
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