MicroRNA-155調(diào)控在人椎間盤退變中的作用研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　目前認(rèn)為椎間盤退變?yōu)轶w內(nèi)外多種因素綜合作用的結(jié)果，凋亡的增加為其中的因素之一，而凋亡增加確切的分子機(jī)制尚不明確。研究表明，內(nèi)在性和外源性凋亡信號(hào)通路在人椎間盤髓核細(xì)胞的凋亡中均發(fā)揮作用。越來越多的證據(jù)表明凋亡機(jī)制受新近發(fā)現(xiàn)的非編碼小RNA，即miRNAs的調(diào)控。miRNAs廣泛參與蛋白表達(dá)的調(diào)控，在機(jī)體的多種生理和病理過程中發(fā)揮重要的作用，但是目前對(duì)其在椎間盤退變中的表達(dá)譜及發(fā)揮的作用知之甚少。本研究的目的為

2、闡述miRNAs，特別是miR-155，在椎間盤退變中的作用。
　　方法：
　　我們收集脊柱側(cè)彎(n=12)和椎間盤退變患者(n=12)的椎間盤髓核組織為對(duì)照和退變的髓核標(biāo)本。我們首先從新鮮分離的人髓核細(xì)胞中分離提取總RNA，繼以miRNA芯片上進(jìn)行RNA標(biāo)記和雜交、分析。miRNA的相對(duì)表達(dá)量以實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證。miR-155調(diào)控的靶蛋白以miRNAs網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)和計(jì)算機(jī)分析進(jìn)行預(yù)測(cè)。miR-155和潛在靶蛋白的3’-UT

3、Rs的作用通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)行分析。我們對(duì)體外培養(yǎng)的人髓核細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)pre-miR-155的慢病毒及表達(dá)antigomiR-155的慢病毒實(shí)現(xiàn)miR-155的上調(diào)和下調(diào)。轉(zhuǎn)染成功后，以重組人FasL誘導(dǎo)凋亡后，以Western蛋白印跡檢測(cè)髓核細(xì)胞中FADD和caspase-3的表達(dá)水平，以APC-AnnexinV/7-AAD雙染流式細(xì)胞分析髓核細(xì)胞凋亡率的變化。我們以透射電鏡檢測(cè)對(duì)照組和椎間盤退變組髓核組織中的凋亡。我們以原位雜

4、交，免疫組化及雙標(biāo)染色檢測(cè)miR-155，F(xiàn)ADD和caspase-3于髓核中的表達(dá)和分布。
　　結(jié)果：
　　我們發(fā)現(xiàn)人椎間盤退變髓核中29個(gè)miRNAs為差異表達(dá)，miR-155下調(diào)了0.56±0.17倍，實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)一步證實(shí)了miR-155的下調(diào)。生物信息方法預(yù)測(cè)FADD和caspase-3為miR-155的潛在靶蛋白。miR-155可通過直接作用于其3’UTRs而抑制FADD和caspase-3的表達(dá)，而靶蛋白3’

5、UTR與miR-155結(jié)合位點(diǎn)的突變可組織這種抑制作用。人髓核細(xì)胞中上調(diào)miR-155的表達(dá)引起FADD和caspase-3表達(dá)的下調(diào)，而下調(diào)miR-155的表達(dá)則引起FADD和caspase-3的上調(diào)。流式細(xì)胞分析證實(shí)下調(diào)miR-155后Fas介導(dǎo)的凋亡增加，而上調(diào)miR-155后Fas介導(dǎo)的凋亡減少。同時(shí)，我們提供了椎間盤退變組織髓核細(xì)胞凋亡的透射電鏡下的直接依據(jù)。而且，miR-155表達(dá)定位于人髓核細(xì)胞胞漿中，F(xiàn)ADD和caspa

6、se-3表達(dá)于髓核細(xì)胞胞漿近胞膜處，兩者的表達(dá)為反相關(guān)，即表達(dá)miR-155的細(xì)胞為靶蛋白陰性，表達(dá)靶蛋白的細(xì)胞為miR-155陰性。另一方面，對(duì)照組及退變組髓核均主要由活細(xì)胞構(gòu)成(87.42±1.13％;83.27±5.00％,p>0.05)，細(xì)胞形態(tài)多種多樣，電鏡下可分類為典型的髓核細(xì)胞，有長(zhǎng)突起的髓核細(xì)胞及具有吞噬功能的髓核細(xì)胞。而且，有長(zhǎng)突起的髓核細(xì)胞存在于椎間盤退變的髓核中，吞噬功能的髓核細(xì)胞既有組織巨噬細(xì)胞溶酶體的特點(diǎn)，又有

7、髓核細(xì)胞多量?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)的特點(diǎn)。
　　結(jié)論：
　　本研究為目前首次對(duì)人椎間盤退變中凋亡增加的潛在分子機(jī)制及miRNAs表達(dá)譜進(jìn)行的研究。同時(shí)，我們確定了caspase-3為miR-155調(diào)控的新的靶蛋白。我們的研究表明，在人椎間盤退變中，下調(diào)的miR-155通過對(duì)靶蛋白FADD和caspase-3的調(diào)控促進(jìn)Fas介導(dǎo)的凋亡，提示miR-155在椎間盤退變的病因?qū)W中的作用。而且，人退變椎間盤髓核中的細(xì)胞主要為活細(xì)胞，我們提供了直接的