17β-雌激素調(diào)控大鼠髓核細胞自噬在椎間盤退變中作用的研究.pdf

1、目的：
　　本實驗旨在初步探討在17β-Estradiol處理下髓核細胞中自噬與凋亡的關(guān)系及二者在椎間盤退變中的作用。
　　方法：
　?。?）體外分離培養(yǎng)SD大鼠髓核細胞，倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，甲苯胺藍、阿利新藍染色及II膠原蛋白免疫組化染色鑒定原代培養(yǎng)的細胞類型。
　?。?）予于血清剝奪12、24、48、72H來誘導(dǎo)髓核細胞凋亡和自噬，然后用MDC染色、Annexin V-FITC/PI熒光染色法和

2、Western blotting方法檢測細胞凋亡、自噬和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達水平變化，確立血清剝奪所致髓核細胞退變的最佳作用時間。
　?。?）加入17β-Estradiol并使其在培養(yǎng)液內(nèi)的最終濃度分別為10-11、10-9、10-7M，隨后使用Western blotting檢測髓核細胞內(nèi)自噬水平改變以及凋亡蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達情況。用流式細胞儀檢測不同濃度17β-Estradiol作用下的髓核細胞的凋亡率變化情況。

3、>　　（4）應(yīng)用自噬抑制劑預(yù)處理髓核細胞并通過流式細胞術(shù)、Western blotting方法、mCherry-GFP-LC3-adenovirus轉(zhuǎn)染觀察17β-Estradiol與血清剝奪誘導(dǎo)的髓核細胞自噬與凋亡之間的關(guān)系和可能存在的作用機制。
　　結(jié)果：
　　（1）分離培養(yǎng)的SD大鼠髓核細胞在倒置相差顯微鏡下觀察大多呈多角形。正常髓核細胞大多數(shù)為圓形或橢圓形，可見多個核仁；經(jīng)甲苯胺藍染色后胞漿呈藍色，細胞核呈紫藍色；阿

4、爾新藍染色后細胞質(zhì)呈淡藍色；Ⅱ型膠原免疫細胞化學(xué)染色見細胞質(zhì)黃色，細胞核周圍散在棕黃色顆粒。
　　（2）在血清剝奪處理下大鼠髓核細胞凋亡的表達水平明顯高于對照組并呈現(xiàn)時間效應(yīng)，自噬的表達水平也明顯升高，但是在作用48h之后開始下降。
　?。?）10-7 M17β-Estradiol能夠顯著提高血清剝奪48小時誘導(dǎo)的髓核細胞自噬并減少凋亡。
　　（4） Western blot分析表明，當(dāng)預(yù)先使用自噬抑制劑3-MA處理細

5、胞1h后再加入17β-Estradiol與細胞共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)Beclin-1和LC3-II/Ⅰ的表達被明顯抑制，而蛋白cleaved caspase-3、MMP-3、MMP-13的表達卻顯著增加。流式細胞儀分析顯示的結(jié)果與Western blot一致，加入3-MA后細胞凋亡率明顯升高。熒光顯微鏡下計數(shù)mCherry-GFP-LC3-adenovirus轉(zhuǎn)染的自噬泡10-7 M的17β-Estradiol組明顯高于10-7 M的17β-E