細(xì)胞自噬在退變椎間盤(pán)中的表達(dá)和作用及其相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、第一部分體外培養(yǎng)中饑餓大鼠髓核細(xì)胞的自噬表達(dá)及其相關(guān)作用
　　 目的:本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)SD大鼠的髓核細(xì)胞，探討細(xì)胞自噬在體外培養(yǎng)的髓核細(xì)胞中的表達(dá)情況及其對(duì)髓核細(xì)胞的作用。
　　 方法:取30只SD大鼠，顯微鏡下分離髓核組織，使用酶消化法培養(yǎng)原代的髓核細(xì)胞，并使用阿利辛和甲苯胺藍(lán)染色以及Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)髓核細(xì)胞中的蛋白多糖和Ⅱ型膠原來(lái)驗(yàn)證髓核細(xì)胞的類(lèi)軟骨性。取2-3代的髓核細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同的處理后，細(xì)胞的自

2、噬泡表達(dá)水平使用單丹璜酰戊二胺(MDC)染色和透射電鏡(TEM)進(jìn)行觀察，細(xì)胞自噬標(biāo)記物L(fēng)C3和Beclin-1的表達(dá)則用Western-blot觀察。細(xì)胞的凋亡率和生長(zhǎng)抑制率則分別用TUNEL(terminal deoxyribonucleotidyltransferase(TDT)-mediated dUTP-digoxigenin nick end labeling)和CCK8進(jìn)行檢測(cè)。具體分組如下:A組:對(duì)照(control)組

3、，B組:3甲基腺嘌呤+DMEM培養(yǎng)基(3-methyladenine3-MA+Dulbecco's Modified Eagle Medium)組，C組:3MA+Earle's balanced salt solution(EBSS)培養(yǎng)基組，D組: EBSS單純的饑餓組。
　　 結(jié)果:大鼠髓核細(xì)胞呈現(xiàn)梭形和多角形，阿利辛和甲苯胺藍(lán)染色分別呈現(xiàn)淡藍(lán)色和藍(lán)色，Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)則呈現(xiàn)為棕色。電鏡和熒光顯微鏡下觀察到EBSS饑餓誘

4、導(dǎo)下髓核細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量的雙層膜的自噬囊泡，但是3-MA抑制后細(xì)胞自噬泡明顯減少。C組在電鏡下可觀察到典型的核固縮凋亡細(xì)胞結(jié)構(gòu)。自噬標(biāo)記物L(fēng)C3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1/β-Actin的表達(dá)用Western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在單純饑餓組明顯大于3-MA+EBSS處理組和對(duì)照組，但是3-MA+EBSS處理組的細(xì)胞抑制率和凋亡率明顯高于EBSS處理組。
　　 結(jié)論:在體外，細(xì)胞自噬存在于饑餓誘導(dǎo)下的大鼠髓核細(xì)胞中，并且細(xì)胞自

5、噬對(duì)饑餓的髓核細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。
　　 第二部分兔體內(nèi)退變椎間盤(pán)中髓核細(xì)胞自噬的表達(dá)及其作用
　　 目的:本實(shí)驗(yàn)使用針刺法造成日本大耳白兔腰椎間盤(pán)的退變，探討兔椎間盤(pán)發(fā)生退變時(shí)體內(nèi)髓核細(xì)胞中自噬的表達(dá)變化及其對(duì)椎間盤(pán)的作用方法:取50只日本大耳白兔，每組10只，從前外側(cè)入路在L3/4和L5/6的椎間盤(pán)外側(cè)用16G大小的針頭刺入5mm，并且設(shè)立假手術(shù)組為對(duì)照組。在手術(shù)前以及針刺后的2周，4周，8周及12周后麻醉下拍攝

6、腰椎側(cè)位X片及腰椎MRI，處死兔子后取相應(yīng)的椎間盤(pán)使用HE染色觀察椎間盤(pán)退變情況，并在不同時(shí)段取髓核組織后行Western-blot觀察LC3，Beclin-1和P62的表達(dá)量，使用透射電鏡(TEM)觀察髓核細(xì)胞的自噬泡和凋亡情況，并使用TUNEL檢測(cè)髓核細(xì)胞的凋亡水平。
　　 結(jié)果:針刺后2周，4周，8周及12周，從X片上可見(jiàn)椎間隙逐漸狹窄，T2加權(quán)MRI像可見(jiàn)髓核高信號(hào)影逐漸減弱，組織學(xué)上可以觀察到髓核逐漸纖維化，纖維環(huán)出現(xiàn)

7、裂隙。將正常組，術(shù)后4周和12周的椎間盤(pán)進(jìn)行組織學(xué)和影像學(xué)分級(jí)，發(fā)現(xiàn)椎間盤(pán)高度指數(shù)(disc height index DHI)，組織學(xué)分級(jí)和Thompson分級(jí)指數(shù)在退變椎間盤(pán)中較正常椎間盤(pán)均有明顯的改變(P＜0.05)。TEM在8周和12周從髓核細(xì)胞中可以明顯觀察到雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬泡，并且能觀察到髓核細(xì)胞的軟骨凋亡。髓核細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1的表達(dá)量隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增大，P62則逐漸下降。TUNEL顯示