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文檔簡(jiǎn)介
1、第一部分、基質(zhì)硬度調(diào)節(jié)椎間盤軟骨終板細(xì)胞鈣化及其機(jī)制研究
目的:椎間盤退變引發(fā)多種脊柱疾病,然而其發(fā)病機(jī)制并不完全清楚。軟骨終板鈣化是椎間盤退變的使動(dòng)和促進(jìn)因素。椎間盤力學(xué)環(huán)境對(duì)于椎間盤退變具有重要作用。然而,基質(zhì)硬度的改變對(duì)于軟骨終板鈣化的調(diào)節(jié)及其分子機(jī)制目前并不清楚。
方法:本實(shí)驗(yàn)首先采用原子力顯微鏡測(cè)定不同退變程度軟骨終板的基質(zhì)硬度。并利用聚丙烯酰氨凝膠模擬不同退變軟骨終板硬度,研究基質(zhì)硬度對(duì)軟骨終板細(xì)胞行為及
2、促進(jìn)鈣化的影響。進(jìn)一步,我們利用miRNA-mRNA共表達(dá)分析研究miR-20a高硬度促進(jìn)軟骨終板細(xì)胞鈣化中的分子機(jī)制。利用雙熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)miR-20a可以直接靶向ANKH。之后,利用過(guò)表達(dá)/敲低miR-20a、慢病毒過(guò)表達(dá)ANKH等手段明確miR-20a/ANKH軸在高硬度促進(jìn)軟骨終板細(xì)胞鈣化中的關(guān)鍵作用。
結(jié)果:在本實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)軟骨終板基質(zhì)硬度與椎間盤退變等級(jí)呈正相關(guān),高硬度(模擬嚴(yán)重退變時(shí)的軟骨終板基質(zhì)硬度)
3、促進(jìn)軟骨終板細(xì)胞鈣化。進(jìn)一步,我們通過(guò)miRNA-mRNA共表達(dá)分析隨著硬度增加上調(diào)miR-20a表達(dá),同時(shí)下調(diào)ANKH表達(dá)。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)miR-20a直接靶向ANKH3'-UTR,從而抑制ANKH表達(dá)。在高硬度基質(zhì)上,抑制miR-20a可以顯著降低鈣沉積和鈣化相關(guān)基因表達(dá),而過(guò)表達(dá)miR-20a可以促進(jìn)鈣化形成。在高硬度基質(zhì)上,利用慢病毒過(guò)表達(dá)ANKH后可以上調(diào)焦磷酸含量同時(shí)抑制鈣結(jié)節(jié)的形成。進(jìn)一步驗(yàn)證體外實(shí)驗(yàn),我們收集
4、了不同退變程度的病人軟骨終板組織,證實(shí)隨著軟骨終板的退變,其ANKH表達(dá)量下降。
結(jié)論:在本實(shí)驗(yàn)中,我們證實(shí)了miR-20a/ANKH軸在高硬度基質(zhì)促進(jìn)軟骨終板細(xì)胞鈣化中的重要作用,提示miR-20a和ANKH可能作為未來(lái)治療椎間盤退變的重要靶點(diǎn)。
第二部分、髓核祖細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)與分化能力相關(guān)性研究
目的:細(xì)胞力學(xué)特性可以反映出不同的細(xì)胞亞群、疾病狀態(tài)和組織來(lái)源等重要的細(xì)胞生化表型信息。過(guò)去的研究已經(jīng)證實(shí)椎間
5、盤蛻變可以導(dǎo)致細(xì)胞行為和分化能力的改變。髓核祖細(xì)胞具有多向分化能力,可以用作治療椎間盤退變的種子細(xì)胞。然而,對(duì)于髓核祖細(xì)胞分化能力和細(xì)胞力學(xué)特性之間的關(guān)系目前還不清楚,這也阻礙了髓核祖細(xì)胞進(jìn)一步的應(yīng)用。
方法:本部分實(shí)驗(yàn)中,利用原子力顯微鏡測(cè)定不同單克隆亞群的祖細(xì)胞力學(xué)特性(彈性模量、松弛模量、瞬時(shí)模量和)。并利用三系誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(成骨分化、成軟骨分化和成脂分化)對(duì)各個(gè)單細(xì)胞髓核祖細(xì)胞克隆群進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng),運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)
6、髓核祖細(xì)胞力學(xué)特性與其分化能力進(jìn)行相關(guān)性分析。
結(jié)果:我們發(fā)現(xiàn)髓核祖細(xì)胞的彈性模量、松弛模量和瞬時(shí)模量與其成骨分化能力成正相關(guān),髓核祖細(xì)胞的表觀粘度與其成軟骨分化能力成正相關(guān)。
結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明髓核祖細(xì)胞的力學(xué)特性對(duì)預(yù)測(cè)其分化能力,篩選不同祖細(xì)胞亞群具有重要作用。提示生物力學(xué)特性可被用作篩選干細(xì)胞的“Biomarker”,為后續(xù)椎間盤組織工程中種子細(xì)胞的篩選提供了一種基于細(xì)胞力學(xué)的方法,可為椎間盤退變的治療提供分
7、化能力更強(qiáng)的種子細(xì)胞亞群。
第三部分、間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)SDF-1/CXCR4/AKT通路調(diào)節(jié)髓核細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)
目的:前期研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療椎間盤退變?cè)诰徑夂鸵种谱甸g盤退變的病理生理過(guò)程中具有顯著作用。細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)在調(diào)節(jié)細(xì)胞-基質(zhì)相互作用中具有非常重要的作用,尤其是在反應(yīng)細(xì)胞表型和細(xì)胞行為中特異性的改變具有重要價(jià)值。然而在間充質(zhì)干細(xì)胞和髓核細(xì)胞共培養(yǎng)中對(duì)髓核細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)的影響目前還不清楚。
方法:實(shí)
8、驗(yàn)中使用共培養(yǎng)體系,重點(diǎn)研究髓核細(xì)胞的力學(xué)性質(zhì)。利用原子力顯微鏡對(duì)髓核細(xì)胞力學(xué)性質(zhì),包括彈性模量、松弛模量和瞬時(shí)模量等進(jìn)行精確測(cè)定。同時(shí)利用化學(xué)阻斷劑或siRNA技術(shù)研究相關(guān)的信號(hào)通路。在測(cè)定髓核細(xì)胞生物學(xué)活性中,主要考慮了細(xì)胞增殖和基質(zhì)基因表達(dá)情況的分析。
結(jié)果:在本實(shí)驗(yàn)中,我們證明了共培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和退變髓核細(xì)胞將導(dǎo)致退變髓核細(xì)胞的力學(xué)性質(zhì)(彈性模量、松弛模量和瞬時(shí)模量)顯著降低,同時(shí)退變髓核細(xì)胞的生物學(xué)活性上調(diào),但共培
9、養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和正常髓核細(xì)胞,不能觀察到此現(xiàn)象。在共培養(yǎng)退變髓核細(xì)胞后,間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的SDF-1顯著增加。利用藥物抑制劑AMD3100抑制SDF-1或siRNA敲低CXCR4表達(dá)水平后,共培養(yǎng)MSCs使退變髓核細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)降低,生物學(xué)活性上升的現(xiàn)象被抑制,提示SDF-1/CXCR4通路在間充質(zhì)干細(xì)胞調(diào)節(jié)髓核細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)中具有重要作用。進(jìn)一步,我們發(fā)現(xiàn)阻斷AKT和FAK可以顯著減低間充質(zhì)干細(xì)胞或SDF-1重組蛋白誘導(dǎo)的退變髓核細(xì)胞力學(xué)
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