基質(zhì)硬度及細胞力學特性在椎間盤退變中的作用及其機制研究.pdf

1、第一部分、基質(zhì)硬度調(diào)節(jié)椎間盤軟骨終板細胞鈣化及其機制研究
　　目的:椎間盤退變引發(fā)多種脊柱疾病，然而其發(fā)病機制并不完全清楚。軟骨終板鈣化是椎間盤退變的使動和促進因素。椎間盤力學環(huán)境對于椎間盤退變具有重要作用。然而，基質(zhì)硬度的改變對于軟骨終板鈣化的調(diào)節(jié)及其分子機制目前并不清楚。
　　方法:本實驗首先采用原子力顯微鏡測定不同退變程度軟骨終板的基質(zhì)硬度。并利用聚丙烯酰氨凝膠模擬不同退變軟骨終板硬度，研究基質(zhì)硬度對軟骨終板細胞行為及

2、促進鈣化的影響。進一步，我們利用miRNA-mRNA共表達分析研究miR-20a高硬度促進軟骨終板細胞鈣化中的分子機制。利用雙熒光素酶報告基因證實miR-20a可以直接靶向ANKH。之后，利用過表達/敲低miR-20a、慢病毒過表達ANKH等手段明確miR-20a/ANKH軸在高硬度促進軟骨終板細胞鈣化中的關(guān)鍵作用。
　　結(jié)果:在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)軟骨終板基質(zhì)硬度與椎間盤退變等級呈正相關(guān)，高硬度（模擬嚴重退變時的軟骨終板基質(zhì)硬度）

3、促進軟骨終板細胞鈣化。進一步，我們通過miRNA-mRNA共表達分析隨著硬度增加上調(diào)miR-20a表達，同時下調(diào)ANKH表達。通過雙熒光素酶報告基因證實miR-20a直接靶向ANKH3'-UTR，從而抑制ANKH表達。在高硬度基質(zhì)上，抑制miR-20a可以顯著降低鈣沉積和鈣化相關(guān)基因表達，而過表達miR-20a可以促進鈣化形成。在高硬度基質(zhì)上，利用慢病毒過表達ANKH后可以上調(diào)焦磷酸含量同時抑制鈣結(jié)節(jié)的形成。進一步驗證體外實驗，我們收集

4、了不同退變程度的病人軟骨終板組織，證實隨著軟骨終板的退變，其ANKH表達量下降。
　　結(jié)論:在本實驗中，我們證實了miR-20a/ANKH軸在高硬度基質(zhì)促進軟骨終板細胞鈣化中的重要作用，提示miR-20a和ANKH可能作為未來治療椎間盤退變的重要靶點。
　　第二部分、髓核祖細胞力學性質(zhì)與分化能力相關(guān)性研究
　　目的:細胞力學特性可以反映出不同的細胞亞群、疾病狀態(tài)和組織來源等重要的細胞生化表型信息。過去的研究已經(jīng)證實椎間

5、盤蛻變可以導致細胞行為和分化能力的改變。髓核祖細胞具有多向分化能力，可以用作治療椎間盤退變的種子細胞。然而，對于髓核祖細胞分化能力和細胞力學特性之間的關(guān)系目前還不清楚，這也阻礙了髓核祖細胞進一步的應用。
　　方法:本部分實驗中，利用原子力顯微鏡測定不同單克隆亞群的祖細胞力學特性（彈性模量、松弛模量、瞬時模量和）。并利用三系誘導分化培養(yǎng)基（成骨分化、成軟骨分化和成脂分化）對各個單細胞髓核祖細胞克隆群進行誘導分化培養(yǎng)，運用統(tǒng)計學方法對

6、髓核祖細胞力學特性與其分化能力進行相關(guān)性分析。
　　結(jié)果:我們發(fā)現(xiàn)髓核祖細胞的彈性模量、松弛模量和瞬時模量與其成骨分化能力成正相關(guān)，髓核祖細胞的表觀粘度與其成軟骨分化能力成正相關(guān)。
　　結(jié)論:本實驗結(jié)果表明髓核祖細胞的力學特性對預測其分化能力，篩選不同祖細胞亞群具有重要作用。提示生物力學特性可被用作篩選干細胞的“Biomarker”，為后續(xù)椎間盤組織工程中種子細胞的篩選提供了一種基于細胞力學的方法，可為椎間盤退變的治療提供分

7、化能力更強的種子細胞亞群。
　　第三部分、間充質(zhì)干細胞通過SDF-1/CXCR4/AKT通路調(diào)節(jié)髓核細胞力學性質(zhì)
　　目的:前期研究表明間充質(zhì)干細胞移植治療椎間盤退變在緩解和抑制椎間盤退變的病理生理過程中具有顯著作用。細胞力學性質(zhì)在調(diào)節(jié)細胞-基質(zhì)相互作用中具有非常重要的作用，尤其是在反應細胞表型和細胞行為中特異性的改變具有重要價值。然而在間充質(zhì)干細胞和髓核細胞共培養(yǎng)中對髓核細胞力學性質(zhì)的影響目前還不清楚。
　　方法:實

8、驗中使用共培養(yǎng)體系，重點研究髓核細胞的力學性質(zhì)。利用原子力顯微鏡對髓核細胞力學性質(zhì)，包括彈性模量、松弛模量和瞬時模量等進行精確測定。同時利用化學阻斷劑或siRNA技術(shù)研究相關(guān)的信號通路。在測定髓核細胞生物學活性中，主要考慮了細胞增殖和基質(zhì)基因表達情況的分析。
　　結(jié)果:在本實驗中，我們證明了共培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞和退變髓核細胞將導致退變髓核細胞的力學性質(zhì)（彈性模量、松弛模量和瞬時模量）顯著降低，同時退變髓核細胞的生物學活性上調(diào)，但共培

9、養(yǎng)間充質(zhì)干細胞和正常髓核細胞，不能觀察到此現(xiàn)象。在共培養(yǎng)退變髓核細胞后，間充質(zhì)干細胞分泌的SDF-1顯著增加。利用藥物抑制劑AMD3100抑制SDF-1或siRNA敲低CXCR4表達水平后，共培養(yǎng)MSCs使退變髓核細胞力學性質(zhì)降低，生物學活性上升的現(xiàn)象被抑制，提示SDF-1/CXCR4通路在間充質(zhì)干細胞調(diào)節(jié)髓核細胞力學性質(zhì)中具有重要作用。進一步，我們發(fā)現(xiàn)阻斷AKT和FAK可以顯著減低間充質(zhì)干細胞或SDF-1重組蛋白誘導的退變髓核細胞力學