miR-874調(diào)控MMp-2表達(dá)在椎間盤(pán)退變中的作用機(jī)制研究.pdf

1、人椎間盤(pán)退變(intervertebral disc degeneration，IVDD)是脊柱退行性病變發(fā)生的病理基礎(chǔ)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，由IVDD所導(dǎo)致的頸椎功能障礙性疾病在我國(guó)的發(fā)病率高達(dá)6％-10％，且發(fā)病年齡呈年輕化的趨勢(shì)。IVDD的遠(yuǎn)期預(yù)后很差，其晚期的高致殘率也越來(lái)越被醫(yī)學(xué)界重視。該病不僅給患者帶來(lái)嚴(yán)重痛苦，而且對(duì)患者家庭乃至社會(huì)都帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此有效地治療IVDD、預(yù)防殘疾的發(fā)生是關(guān)系國(guó)計(jì)民生的重大科學(xué)問(wèn)題。
　　目

2、前對(duì)于椎間盤(pán)退變的具體機(jī)制仍不甚了解。許多研究發(fā)現(xiàn)髓核細(xì)胞凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度降解是椎間盤(pán)退變的主要病理改變，而MMPs在髓核細(xì)胞凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度降解引起的間盤(pán)退變過(guò)程中，扮演了關(guān)鍵角色。最新的研究表明，IVDD還受到microRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制影響。microRNA是一種長(zhǎng)約19-22bp的小雙鏈RNA，其家族是體內(nèi)天然存在的一種內(nèi)源性調(diào)節(jié)性分子。其在體內(nèi)可以通過(guò)嚴(yán)格或不嚴(yán)格匹配機(jī)制，調(diào)節(jié)靶基因mRNA的翻譯及其降解，可系

3、統(tǒng)性改變一系列基因的表達(dá)，并進(jìn)一步影響細(xì)胞表型的變化。microRNA本身在體內(nèi)也可以接受各種轉(zhuǎn)錄因子及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控。最近，有研究發(fā)現(xiàn)mir-21在IVDD中會(huì)顯著上調(diào)，通過(guò)轉(zhuǎn)錄后抑制PTEN的表達(dá)，促進(jìn)髓核的異常分化，從而在IVDD中發(fā)揮作用。最新的研究還發(fā)現(xiàn)人IVDD中miR-155出現(xiàn)表達(dá)顯著下調(diào)，其能特異性靶向凋亡相關(guān)分子FADD、caspase-3的3'UTR區(qū)，過(guò)表達(dá)mir-155可導(dǎo)致FADD、caspase-3的表

4、達(dá)下調(diào)，從而抑制髓核細(xì)胞的凋亡。上述研究可見(jiàn)microRNA的表達(dá)改變?cè)贗VDD發(fā)生發(fā)展中可能具有重要意義。因此，本課題組設(shè)想，可能存在一條miRNA/MMPs通路，通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控來(lái)影響髓核細(xì)胞凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度降解，進(jìn)一步導(dǎo)致CIDD的發(fā)生發(fā)展。
　　目的：
　　本課題通過(guò)前期研究發(fā)現(xiàn)了miR-874在IVDD中出現(xiàn)表達(dá)異常，隨著退變程度的加重表達(dá)逐漸下調(diào)，而分解代謝及髓核細(xì)胞凋亡相關(guān)分子MMP-2、MMP-3隨著退變程

5、度的加重表達(dá)逐漸上調(diào)，與miR-874的表達(dá)存在負(fù)相關(guān)，提示二者可能存在潛在的相互關(guān)系，在IVDD中共同發(fā)揮重要的作用。但是，上述調(diào)控因素之間如何相互協(xié)作，目前的認(rèn)識(shí)還很不充分，也是當(dāng)前研究的前沿問(wèn)題。如果發(fā)現(xiàn)這些調(diào)控因素間新的相互作用機(jī)制和模式，無(wú)疑大大有利于加深對(duì)IVDD發(fā)生發(fā)展機(jī)制的認(rèn)識(shí)，并有助于推動(dòng)IVDD分子治療的進(jìn)展，具有重要的科學(xué)及社會(huì)意義。
　　針對(duì)上述問(wèn)題，本課題提出一種新的頸椎間盤(pán)退變調(diào)控機(jī)制:microRNA

6、miR-874通過(guò)直接結(jié)合MMP-2的3'UTR區(qū)調(diào)控其表達(dá)豐度，抑制髓核細(xì)胞外基質(zhì)主要成分即Ⅱ型膠原蛋白及蛋白聚糖的表達(dá)，從而促進(jìn)人髓核細(xì)胞凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度降解。通過(guò)多種實(shí)驗(yàn)方法揭示microRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控協(xié)調(diào)參與到人IVDD調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的方式和機(jī)制，找出可干預(yù)的新靶點(diǎn)，為最終有效地防治IVDD并發(fā)的殘疾提供科技支撐。
　　方法：
　　1.明確miR-874與人IVDD相關(guān)，收集不同退變程度椎間盤(pán)髓核組織樣本，抽提

7、RNA，經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄后，qRT-PCR檢測(cè)miR-874在髓核中表達(dá)水平與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性。
　　2.實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-874與MMP-2表達(dá)量相關(guān)，在不同miR-874表達(dá)水平的人髓核樣本中，利用qRT-RCR、Western-blot及免疫組化檢測(cè)MMP-2表達(dá)量，分析miR-874與MMP-2表達(dá)量的相關(guān)性。
　　3.利用miRNA靶向預(yù)測(cè)軟件RNA22進(jìn)行miR-874靶基因生物信息學(xué)分析，在髓核細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-8

8、74模擬物(miR-874 mimics)，qRT-PCR以及Northern-blot檢測(cè)MMP2的表達(dá)水平;構(gòu)建MMP2熒光素酶報(bào)告基因，驗(yàn)證miR-874是否可以靶向調(diào)節(jié)MMP2。
　　4.體外實(shí)驗(yàn)研究miR-874對(duì)IVDD相關(guān)表型的影響，分離培養(yǎng)人髓核細(xì)胞，構(gòu)建miR-874過(guò)表達(dá)以及干擾慢病毒，在髓核細(xì)胞中分別感染上述慢病毒，在過(guò)表達(dá)及干擾/敲除miR-874后分別檢測(cè)如下指標(biāo):Annexin V-APC單染法流式細(xì)胞

9、儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡、MTT髓核細(xì)胞增殖檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。
　　5.研究miR-874對(duì)人髓核細(xì)胞外基質(zhì)的影響，培養(yǎng)人髓核細(xì)胞，感染上述慢病毒，在過(guò)表達(dá)及干擾/敲除miR-874后，利用qRT-RCR以及Western-blot檢測(cè)MMP-2表達(dá)量，并檢測(cè)Ⅱ型膠原及蛋白聚糖等ECM主要成分的表達(dá)情況。
　　6.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-874干預(yù)對(duì)IVDD的作用及機(jī)制，通過(guò)超聲引導(dǎo)下兔椎間盤(pán)纖維環(huán)刺破方法，以18G針頭刺破纖維環(huán)，進(jìn)針深度0.5

10、cm，抽吸部分髓核組織建立兔椎間盤(pán)退變模型。造模成功后，分別與超聲引導(dǎo)下在模型兔的椎間盤(pán)中注射miR-874Agomirs及miR-874 mimics，在時(shí)間點(diǎn)4周、8周、12周分別進(jìn)行X線、MRI檢測(cè)進(jìn)行影像學(xué)評(píng)估，12周后處死IVDD模型動(dòng)物，獲取椎間盤(pán)組織行病理學(xué)檢測(cè)，評(píng)價(jià)miR-874對(duì)IVDD的影響。
　　結(jié)果：
　　1.miR-874在退變較重組髓核組織中下調(diào)了0.7倍，同時(shí)MMP-2 mRNA及蛋白水平表達(dá)上

11、調(diào)，與riR-874的表達(dá)存在負(fù)相關(guān)，而ACAN mRNA及蛋白水平表達(dá)下調(diào)。免疫組化發(fā)現(xiàn)隨著退變的加重，髓核組織中ACAN及Ⅱ型膠原表達(dá)下調(diào)。
　　2.構(gòu)建包含2個(gè)miR-874結(jié)合位點(diǎn)的MMP23'UTR區(qū)報(bào)告基因質(zhì)粒與mir-874共轉(zhuǎn)染，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)熒光素酶活性抑制，證實(shí)二者靶向關(guān)系。
　　3.體外實(shí)驗(yàn)研究，在髓核細(xì)胞中分別感染miR-874過(guò)表達(dá)以及干擾慢病毒后，MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)髓核細(xì)胞增殖在干擾時(shí)非常緩慢，而過(guò)表達(dá)后增

12、殖明顯加快，二者有顯著差異。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示干擾時(shí)凋亡數(shù)增加，而過(guò)表達(dá)后凋亡數(shù)顯著減少，二者有顯著差異。
　　4.體外實(shí)驗(yàn)研究，在髓核細(xì)胞中分別感染miR-874過(guò)表達(dá)以及干擾慢病毒后，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-874導(dǎo)致MMP-2下調(diào)，同時(shí)抑制Aggrecan和CollagenⅡ降解，且發(fā)生COL2A1增加和COL1A1減少，提示細(xì)胞外基質(zhì)合成增多。而下調(diào)miR-874導(dǎo)致相反結(jié)果。
　　5.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，在模型兔的椎間盤(pán)中

13、注射miR-874 Agomirs及miR-874mimics后，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-874可減緩?fù)米甸g盤(pán)退變的進(jìn)程，X線及MRI均發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)組椎間盤(pán)退變程度較下調(diào)組降低，且MMP-2表達(dá)降低，Aggrecan表達(dá)增高，提示細(xì)胞外基質(zhì)合成增多，miR-874為椎間盤(pán)退變中的保護(hù)因子。
　　結(jié)論：
　　1.通過(guò)本課題研究證實(shí)了miR-874通過(guò)調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)分解代謝相關(guān)分子MMP-2表達(dá)，從而抑制Ⅱ型膠原及蛋白聚糖等ECM主要成