miR-874對胃癌新生血管生成影響的研究.pdf

1、胃癌是一種嚴(yán)重威脅人類健康的的消化道惡性腫瘤。全球范圍內(nèi)，胃癌新增病例數(shù)在所有男性惡性腫瘤中排第四位，所有女性惡性腫瘤中排第五位。新增死亡病例數(shù)分別排在第三位和第五位。發(fā)展中國家統(tǒng)計分析，胃癌在男性惡性腫瘤發(fā)病率排第三位，女性中排第五位。盡管我們在診斷和治療技術(shù)已經(jīng)取得巨大進(jìn)步，但由于早期診斷的困難和進(jìn)展期胃癌的不良預(yù)后導(dǎo)致其生存率仍然較低。這意味著必須尋找新的治療策略。惡性腫瘤需要血液供應(yīng)才能持續(xù)生長和發(fā)生血行轉(zhuǎn)移。腫瘤如果沒有新生血

2、管形成，直徑將不能達(dá)到2mm。長期以來，人們一直認(rèn)為從血管內(nèi)皮來源的新生血管是腫瘤獲得血液供應(yīng)的唯一途徑，臨床治療主要以血管內(nèi)皮細(xì)胞為靶點，使用內(nèi)皮抑素及血管抑素等抗血管生成藥物治療惡性腫瘤，但仍有一半以上的腫瘤病人因復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移致死。最近的研究表明，miRNAs參與調(diào)控腫瘤血管的形成。miRNA-378通過作用于Sufu和fus-1促進(jìn)腫瘤血管生成。miRNA-132作為血管調(diào)節(jié)開關(guān)通過抑制p120rasGAP的表達(dá)，導(dǎo)致RAS激活和誘

3、導(dǎo)新生血管生成。相反，miR-15b，miR-16，miR-20a和miR-20b是通過靶向VEGF的潛在抗血管生成的microRNA。在前期的研究中，我們證明了miR-874可以抑制胃癌細(xì)胞的生長，遷移和侵襲。我們在裸鼠皮下移植瘤實驗中也觀察到，相對于miR-874抑制組，過表達(dá)miR-874的裸鼠皮下移植瘤較小，并且微血管密度(MVD)較低。然而，miR-874潛在調(diào)控血管生成的機(jī)制仍然未知。
　　目的：針對miR-874與胃

4、癌血管形成的作用及調(diào)控機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究，為胃癌的靶向治療提供新的策略。
　　方法：⑴通過Tagman RT-PCR檢測miR-874在胃癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)情況；⑵通過構(gòu)建miR-874干擾、過表達(dá)病毒，轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞株SGC-7901與AGS中，利用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株；⑶通過胃癌細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)共培養(yǎng)策略在體外用CCK8、transwell、小管形成方法檢測miR-874干擾、過表達(dá)胃癌細(xì)胞株對H

5、UVEC增殖、遷移、侵襲以及小管形成能力的影響；⑷通過qRT-PCR、western-blot檢測miR-874干擾、過表達(dá)胃癌細(xì)胞株中VEGF-A基因的表達(dá)情況；⑸通過ELISA檢測miR-874干擾、過表達(dá)胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF-A的分泌量的改變情況；⑹通過裸鼠皮下成瘤，觀察miR-874干擾、過表達(dá)胃癌細(xì)胞致瘤性的；⑺在線軟件預(yù)測miR-874的下游靶基因，3'-UTR熒光素酶報告基因驗證miR-874的下游靶基因；⑻通過RT

6、-PCR以及Western-blot檢測STAT3在干擾、過表達(dá)miR-874細(xì)胞中的表達(dá)情況；⑼構(gòu)建STAT3干擾以及過表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞后，應(yīng)用CCK8，transwell，小管形成方法在體外檢測對HUVEC增殖，遷移以及侵襲的影響；⑽應(yīng)用ELISA檢測胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF-A的分泌改變量；⑾應(yīng)用western blot以及RT-PCR檢測胃癌細(xì)胞中VEGF-A的變化；⑿通過裸鼠皮下成瘤實驗以及免疫組化檢測異位種植瘤內(nèi)S

7、TAT3的表達(dá)情況；⒀通過western blot檢測STAT3在胃癌組織中的表達(dá)情況，再次驗證miR-874與STAT3的相關(guān)性。
　　結(jié)果：①miR-874在胃癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織，并在胃癌細(xì)胞株中呈現(xiàn)低表達(dá)；②通過干擾胃癌細(xì)胞株SGC-7901中miR-874后，發(fā)現(xiàn)HUVEC增殖、遷移、侵襲以及小管形成能力明顯增強(qiáng)，而過表達(dá)胃癌細(xì)胞株AGS中miR-874后，發(fā)現(xiàn)HUVEC增殖、遷移、侵襲以及小管形成能力明顯減弱

8、；③通過qRT-PCR、western-blot檢測miR-874干擾胃癌細(xì)胞株SGC-7901中VEGF-A基因表達(dá)增加，miR-874過表達(dá)胃癌細(xì)胞株AGS中VEGF-A基因表達(dá)降低；④應(yīng)用ELISA檢測miR-874干擾胃癌細(xì)胞株SGC-7901培養(yǎng)上清中VEGF-A的分泌改變量增加，miR-874過表達(dá)胃癌細(xì)胞株AGS培養(yǎng)上清中VEGF-A的分泌改變量減少；⑤體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)干擾胃癌細(xì)胞株miR-874后，致瘤性增強(qiáng)，免疫組化檢測種

9、植瘤中CD31、VEGF-A的表達(dá)增多，而過表達(dá)胃癌細(xì)胞株miR-874后，致瘤性減弱，免疫組化檢測種植瘤中CD31、VEGF-A的表達(dá)減低；⑥在線軟件預(yù)測STAT3可能是miR-874的下游靶基因，3'-UTR熒光素酶報告基因證實STAT3是miR-874的下游靶基因之一，并證實miR-874是在轉(zhuǎn)錄后水平抑制STAT3的表達(dá)；⑦通過干擾miR-874-inhibitor胃癌細(xì)胞株中的STAT3后，發(fā)現(xiàn)HUVEC增殖、遷移以及侵襲能力

10、明顯下降，而過表達(dá)pre-miR-874胃癌細(xì)胞株中的STAT3后，發(fā)現(xiàn)HUVEC增殖、遷移以及侵襲能力明顯增強(qiáng)；⑧通過ELISA檢測胃癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF-A的分泌改變量情況，發(fā)現(xiàn)干擾STAT3基因表達(dá)后，VEGF-A蛋白分泌減少，而過表達(dá)STAT3基因表達(dá)后，VEGF-A蛋白分泌增加；⑨體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)干擾胃癌細(xì)胞株miR-874后，致瘤性增強(qiáng)，免疫組化檢測種植瘤中STAT3的表達(dá)增多，而過表達(dá)胃癌細(xì)胞株miR-874后，致瘤性減弱

11、，免疫組化檢測種植瘤中STAT3的表達(dá)減低；⑩通過western blot檢測STAT3在胃癌組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miR-874表達(dá)與STAT3呈負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論：⑴miR-874在胃癌組織及細(xì)胞中低表達(dá)，干擾miR-874后，胃癌細(xì)胞株血管形成能力增強(qiáng)，而過表達(dá)miR-874后，胃癌細(xì)胞株血管形成能力減弱，在胃癌血管形成中起到抑制作用；⑵STAT3是miR-874特異性靶基因之一；⑶miR-874通過下調(diào)STAT3的表達(dá)，在