DLL4-Notch信號途徑在胃癌新生血管生成中的作用及其機制.pdf

1、目的：胃癌是常見的惡性腫瘤，與其他實體腫瘤相似，新生血管生成在胃癌發(fā)生、發(fā)展和轉移過程中發(fā)揮重要作用。Delta-like ligand4(DLL4)作為Notch信號途徑中的一個重要配體，參與復雜的信號傳導通路，通過相鄰細胞之間通訊調控細胞發(fā)育。近年研究發(fā)現(xiàn)：DLIA在人類多種腫瘤血管組織中過表達，并與腫瘤分子生物學特性密切相關，但DLL4/Notch信號途徑在腫瘤新生血管生成中的作用及機制尚缺乏了解。本課題以胃癌為例，初步探討DLL

2、4/Notch信號途徑在胃癌新生血管生成中的作用及其機制，期望為胃癌抗血管生成提供新的靶點與理論依據(jù)。
　　 方法：(1)收集92例外科手術切除胃癌標本及距病灶約5cm的癌旁正常胃粘膜組織制作組織芯片，采用免疫組化技術檢測DLL4的表達，分析其與胃癌臨床病理參數(shù)的關系；(2)構建一個表達DLL4小干擾RNA的重組腺相關病毒載體，制備靶向性抑制DLL4表達的高滴度重組腺相關病毒(rAAV2-U6-DLLA-shRNA-EGFP)；

3、(3)將rAAV2-U6-DLL4-shRNA-EGFP感染HUVECs細胞，半定量RT-PCR，Western blot分別檢測HUVECs細胞DLL4-mRNA和DLL4蛋白的改變；流式細胞技術分析細胞周期分布，MTT比色法檢測細胞的生長變化，采用Matrigel三維培養(yǎng)系統(tǒng)觀測HUVECs體外血管形成能力的變化；(4)建立胃癌細胞的荷瘤裸鼠模型，將rAAV-DLL4-shRNA予以荷瘤組織局部注射，觀察腫瘤生長情況；應用免疫組化法

4、觀察腫瘤微血管數(shù)量、腫瘤微血管形態(tài)及腫瘤組織中Ephrin B2、DLL4蛋白表達的改變。
　　 結果：(1)DLL4在胃癌組織中的表達明顯高于癌旁正常胃粘膜(85.9％vs35.3％，P<0.01)。DLL4表達與胃癌的轉移(r=0.612，P<0.01)和胃壁浸潤深度(r=0.482，P<0.01)呈正相關。DLIA表達陽性組的MVD指數(shù)明顯高于DLL4表達陰性組(70.5±16.2 vs32.5±10.4)，DLLA表達與

5、MVD呈正相關(r=0.521，P<0.01)(2)PCR和測序證實，成功構建包含U6啟動子和DLL4特異性RNA干擾片段的重組腺相關病毒載體pSNAV2.0-shRNA-DLL4，并制備出滴度為2.4×1011vectorgenome/L的高滴度腺相關病毒rAAV2-U6-DLL4-shRNA-EGFP；(3)重組腺相關病毒載體能明顯抑制HUVECs細胞DLIA-mRNA和DLIA蛋白的表達(P<0.05)，促進HUVECs細胞株的生

6、長增殖，細胞周期中G0/G1比例降低，S期比例明顯上升，實驗組細胞增殖指數(shù)為39.90±2.19％，對照組細胞的增殖指數(shù)為25.74±4.54％.P<0.05。HUVECs在Matrigel形成小管樣結構能力增強，TLS長度均明顯增加(P<0.05)；(4)rAAV2-U6-DLL4-shRNA-EGFP重組腺相關病毒能有效抑制荷瘤裸鼠腫瘤生長，腫塊的體積和重量明顯小于對照組(P<0.05)，腫瘤組織中微血管密度明顯高于對照組，但腫瘤微

7、血管形態(tài)以不成熟的點狀型和線狀型為主。腫瘤組織中的DLL4、Ephrin B2蛋白表達下降，與MVD者成負相關(r=-0.510，P<0.05； r=-0.410，P<0.05)。
　　 結論：①DLIA與胃癌組織新生血管生成及病理生物學行為關系密切，其表達水平可作為判斷胃癌侵襲轉移情況及患者預后的參考指標之一。②特異性阻斷DLL4/Notch信號途徑能有效促進HUVECs細胞增殖，增強HUVECs在Matrigel形成小管樣結