Notch信號途徑在膠質(zhì)瘤發(fā)病機制中的作用研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見,致死率最高的惡性腫瘤,具有高度的異型性、較強的侵襲能力及對放化療抵抗的特點,死亡率高居顱腦疾病的第二位。由于其發(fā)病機制尚不完全清楚,因此,目前仍缺乏針對膠質(zhì)瘤有效的治療方法,惡性程度最高的膠質(zhì)瘤中位生存期只有14.6個月,5年生存率僅為9.8％,因此,探索針對膠質(zhì)瘤的有效治療方法是神經(jīng)外科學(xué)界亟待解決的醫(yī)學(xué)難題,而通過膠質(zhì)瘤致病機制的研究有望為膠質(zhì)瘤的治療提供新的輔助治療手段。
　　近年的多項研究證實,

2、膠質(zhì)瘤中存在一群數(shù)量少但較特殊的細胞,這群細胞具有干細胞特征,被稱為膠質(zhì)瘤干細胞(Glioma stem cells,GSCSs),這些細胞具有如下特點:可快速增殖,具有多向分化的潛能、容易體外成瘤、對放化療不敏感。研究認為,這群細胞的存在是膠質(zhì)瘤治療效果差和容易復(fù)發(fā)的主要原因。因此除了目前常規(guī)針對非膠質(zhì)瘤干細胞的聯(lián)合治療手段外,研究調(diào)控GSCs的關(guān)鍵分子和主要的信號通路,尋找靶向消除GSCs的有效治療方法可為膠質(zhì)瘤的治療提供新的輔助治

3、療手段。
　　Notch信號途徑在進化上高度保守,在細胞增殖、分化、命運決定方面有著非常重要作用。研究表明,Notch信號途徑在膠質(zhì)瘤中處于激活狀態(tài),可參與正常神經(jīng)干細胞和膠質(zhì)瘤干細胞的自我更新、促進其增殖、抑制其分化。抑制 Notch信號途徑可耗竭膠質(zhì)瘤中的膠質(zhì)瘤干細胞,促進膠質(zhì)瘤干細胞對放化療的敏感性。因此,Notch信號途徑在膠質(zhì)瘤干細胞惡性表型維持方面起著至關(guān)重要的作用,但是Notch信號途徑調(diào)控膠質(zhì)瘤干細胞的具體機制研究

4、仍不夠深入。
　　本人所在研究團隊前期研究表明,在小鼠KyoT2(人為FHL1C)可與Notch信號途徑關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子RBP-J結(jié)合進而抑制Notch信號途徑,基于Notch信號途徑在膠質(zhì)瘤中的重要作用,我們假設(shè)FHL1C可通過Notch信號途徑抑制膠質(zhì)瘤及膠質(zhì)瘤干細胞的增殖,并促進膠質(zhì)瘤干細胞的分化,進而達到治療膠質(zhì)瘤的目的。但是我們進行的western blot實驗,并未檢測到FHL1C在膠質(zhì)瘤與膠質(zhì)瘤周圍正常腦組織中的表達,

5、與我們預(yù)測的結(jié)果FHL1C與Notch信號途徑呈負相關(guān)關(guān)系不一致;但意外的是,我們發(fā)現(xiàn)FHL1的另外一個不同的亞型FHL1A在正常腦組織中的表達明顯高于腫瘤組織,這個意外的發(fā)現(xiàn)引起了我們的關(guān)注。
　　通過文獻查閱及我們預(yù)實驗結(jié)果,我們推測FHL1A可能在膠質(zhì)瘤中起抑癌基因的作用,因此我們進行了如下實驗
　　第一部分:
　　目的:
　　探討FHL1A在膠質(zhì)瘤標(biāo)本中的表達及其與膠質(zhì)瘤級別和膠質(zhì)瘤患者預(yù)后之間的關(guān)系;研

6、究FHL1A對膠質(zhì)瘤增殖的抑制作用,并進一步揭示FHL1A抑制膠質(zhì)瘤增殖的分子機制;為建立以FHL1A為靶點的膠質(zhì)瘤分子靶向治療提供理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1、進行免疫組化及western blot檢測FHL1A在46例膠質(zhì)瘤與膠質(zhì)瘤周圍正常腦組織之間表達的差異;
　　免疫組化檢測FHL1A在114例不同級別膠質(zhì)瘤中的表達差異;
　　進一步研究FHL1A的表達與114例患者臨床病理特點及患者預(yù)后之間的相關(guān)性;

7、
　　2、建立FHL1A過表達的U87穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系以及FHL1A下調(diào)的U251穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系,并通過MTT實驗及流式細胞技術(shù)檢測FHL1A對膠質(zhì)瘤細胞系增殖的影響;
　　3、進一步揭示 FHL1A通過 PI3K/AKT信號通路影響膠質(zhì)瘤增殖的機制,并利用PI3K/AKT信號通路特異性抑制劑 LY294002進行表型挽救實驗,以進一步闡明FHL1A影響膠質(zhì)瘤增殖的機制。
　　結(jié)果
　　1. FHL1C在膠質(zhì)瘤及其周圍正常

8、腦組織均無表達;而FHL1A在膠質(zhì)瘤中表達低于相應(yīng)腫瘤周圍正常腦組織(p=0.0419<0.05),FHL1A的表達與膠質(zhì)瘤級別呈負相關(guān)關(guān)系,且FHL1A低表達患者預(yù)后差;
　　2. FHL1A在間變型膠質(zhì)瘤細胞系U251中表達較高,而在GBM細胞系U87中無表達,在U87中過表達FHL1A可抑制膠質(zhì)瘤的增殖、而在U251中干涉FHL1A的表達可促進其增殖;
　　3. FHL1A可抑制PI3K/AKT信號通路,進而抑制膠質(zhì)瘤

9、增殖。進一步表型挽救實驗表明,阻斷PI3K/AKT信號通路后,干涉FHL1A促進增殖的效應(yīng)收到抑制,因此進一步說明FHL1A通過抑制PI3K/AKT信號通路抑制膠質(zhì)瘤的增殖。
　　結(jié)論
　　1. FHL1C可能并未參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生及發(fā)展;
　　2. FHL1A可通過PI3K/AKT信號通路抑制膠質(zhì)瘤的增殖,有望作為膠質(zhì)瘤治療新的分子治療靶點。
　　3. Notch對膠質(zhì)瘤的調(diào)控機制還有待進一步研究;
　　4

10、.我們推測Notch可能是通過miRNAs來對膠質(zhì)瘤進行調(diào)控。
　　第二部分:
　　本人所在的研究團隊前期對抑制Notch信號途徑的基因敲除小鼠(RBP-J基因剔除小鼠)和其同窩野生對照小鼠的神經(jīng)干細胞克隆球進行了原代培養(yǎng),并將3對6個樣品進行 miRNA基因芯片分析,發(fā)現(xiàn)了兩組之間的一組差異表達的miRNAs,其中miR-342-5p表達差異最為明顯,該芯片結(jié)果說明抑制 Notch信號途徑可上調(diào)miR-342-5p的表達;

11、多項研究表明膠質(zhì)瘤與神經(jīng)干細胞具有相似的miRNAs表達譜,而且部分調(diào)控神經(jīng)干細胞的miRNA可同時參與膠質(zhì)瘤干細胞的調(diào)控。
　　因此我們假設(shè)在 GSCs中,miR-342-5p也受 Notch信號途徑的調(diào)控,同時miR-342-5p可能參與膠質(zhì)瘤干細胞惡性表型的調(diào)控,為此,我們進行了第二部分實驗對我們的假設(shè)加以驗證:
　　目的:
　　探討在 GSCs中 Notch信號途徑對 miR-342-5p表達的調(diào)控;進一步明確

12、miR-342-5p在膠質(zhì)瘤及其周圍正常腦組織間的表達差異以及miR-342-5p的表達與膠質(zhì)瘤級別的相關(guān)性;研究 miR-342-5p對 GSCs增殖及分化的影響,進一步揭示miR-342-5p調(diào)控GSCs的分子機制。為建立以Notch信號途徑及miR-342-5p為靶點,靶向消除GSCs進而達到治療膠質(zhì)瘤的目的。
　　方法:
　　1.通過實時定量PCR的方法分析miR-342-5p在膠質(zhì)瘤與正常腦組織、不同級別膠質(zhì)瘤之間

13、的表達差異;
　　2.建立膠質(zhì)瘤干細胞原代培養(yǎng)體系,并進行膠質(zhì)瘤干細胞標(biāo)記及誘導(dǎo)分化后子代細胞標(biāo)記進行鑒定;
　　3.在膠質(zhì)瘤干細胞中通過實時定量PCR驗證Notch信號通路對miR-342-5p的調(diào)控;同時分析miR-342-5p在膠質(zhì)瘤干細胞與非膠質(zhì)瘤干細胞之間的表達差異;
　　4.通過免疫熒光及實時定量PCR觀察miR-342-5p對膠質(zhì)瘤干細胞增殖及分化的影響;
　　5.通過報告基因?qū)嶒灱?western

14、 blot實驗觀察 miR-342-5p對下游靶基因Pokemon(ZBTB7A)的調(diào)控作用。
　　結(jié)果
　　1. miR-342-5p在膠質(zhì)瘤中表達明顯低于相應(yīng)瘤周正常腦組織,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0157<0.05);miR-342-5p的表達與膠質(zhì)瘤的級別呈負相關(guān)關(guān)系,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0078<0.05);
　　2.建立了穩(wěn)定的體外原代培養(yǎng)GSCs的培養(yǎng)體系
　　3.γ分泌酶抑制劑(GS

15、I)阻斷Notch信號途徑后,膠質(zhì)瘤干細胞中miR-342-5p的表達降低,與未阻斷組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;
　　4. miR-342-5p可抑制膠質(zhì)瘤干細胞的增殖,并抑制其分化;
　　5.報告基因及 western blot實驗表明 miR-342-5p可抑制癌基因 Pokemon(ZBTB7A)的表達。
　　結(jié)論:
　　1. miR-342-5p在膠質(zhì)瘤表達低于正常腦組織,與膠質(zhì)瘤惡性程度呈負相關(guān);