Basigin-CD147在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤侵襲中的作用機(jī)制及其反義RNA抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤侵襲的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)常見惡性腫瘤，占顱內(nèi)腫瘤的35.26％～60.96％，平均44.69％，目前尚無根治方法。膠質(zhì)瘤具有發(fā)病率、復(fù)發(fā)率、死亡率高和治愈率低等“三高一低”的特點(diǎn)。惡性膠質(zhì)瘤預(yù)后極差，中位生存時(shí)間少于18個(gè)月，2年存活率約為5％。膠質(zhì)瘤多呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，手術(shù)難以全切，需結(jié)合放療、化療、生物治療等綜合治療手段以延長(zhǎng)病人生存期。隨著影像學(xué)技術(shù)的發(fā)展，膠質(zhì)瘤的診斷、治療取得了一定進(jìn)展，但總體療效并未實(shí)現(xiàn)突破。因此，神經(jīng)膠質(zhì)瘤是神經(jīng)外科的難題

2、和醫(yī)學(xué)研究的重要課題之一。 造成神經(jīng)膠質(zhì)瘤死亡率高的主要原因是神經(jīng)膠質(zhì)瘤的高侵襲性。其侵襲過程中的一個(gè)重要因素是細(xì)胞外基質(zhì)的降解，其中，起重要作用的是一類Zn2+依賴的基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs（Matrix metalloproteinases）。MMPs能夠破壞局部組織結(jié)構(gòu)和基底膜屏障，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，并且可促進(jìn)腫瘤新生血管的形成。CD147作為MMPs的誘導(dǎo)因子，是一個(gè)廣泛表達(dá)的質(zhì)膜糖蛋白，參與機(jī)體多種生理和病理過程。CD

3、147分子表達(dá)于許多正常細(xì)胞類型，包括成體和胚胎組織。它在炎癥的發(fā)生發(fā)展、病毒的易化介導(dǎo)、細(xì)胞之間的黏附及胚胎發(fā)育等方面起著一定的作用。研究證實(shí)，CD147表達(dá)于各種腫瘤組織特別是惡性腫瘤，如乳腺癌、肺癌、腎癌、惡性黑色素瘤、淋巴瘤等，同時(shí)其表達(dá)較相應(yīng)正常組織明顯要高。 近年來一些研究發(fā)現(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，CD147表達(dá)于血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞、脈絡(luò)膜上皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，并在血腦屏障中起作用。但缺乏CD147分子在神經(jīng)系統(tǒng)及

4、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中表達(dá)的系統(tǒng)性研究。以往研究雖然表明CD147功能上與某些惡性腫瘤，如肝癌存在相關(guān)性，提示其在致病機(jī)制上是一個(gè)非常重要的因子，但更明確的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步深入探討。另外，CD147在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，尤其是神經(jīng)膠質(zhì)瘤侵襲中的作用如何還不明確。 本研究收集了18例神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣本，并采用63點(diǎn)膠質(zhì)瘤組織芯片檢測(cè)Basigin/CD147在人腦組織及神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況。分別在組織水平及基因水平分析了Basigin/C

5、D147的表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系；構(gòu)建Basigin/CD147反義RNA表達(dá)載體，建立并篩選低表達(dá)CD147的重組人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251/147的克?。徊⑦M(jìn)一步采用反義RNA技術(shù)研究Basigin/CD147在膠質(zhì)瘤侵襲、血管形成方面的作用及機(jī)制。 第一部分：Basigin/CD147 在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及臨床意義。 收集了18例神經(jīng)膠質(zhì)瘤樣本，并采用63點(diǎn)膠質(zhì)瘤組織芯片檢測(cè)CD147的表達(dá)情況。結(jié)果

6、發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中Basigin/CD147表達(dá)于腫瘤細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，但未見細(xì)胞核染色。神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中Basigin/CD147蛋白的陽性表達(dá)率為74.3％。而正常腦組織中僅血管內(nèi)皮細(xì)胞漿有陽性著色，神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞未見表達(dá)。表明在正常腦組織中CD147僅表達(dá)于血管內(nèi)皮。此研究結(jié)果說明與正常腦組織相比，神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中Basigin/CD147存在過度表達(dá)。不同級(jí)別膠質(zhì)瘤細(xì)胞著色結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞胞漿中有CD147

7、著色，并且高級(jí)別星型膠質(zhì)瘤（III、IV級(jí)）瘤細(xì)胞胞漿CD147著色顯著強(qiáng)于低級(jí)別星型膠質(zhì)瘤（I、II級(jí)）。說明膠質(zhì)瘤細(xì)胞不僅表達(dá)CD147，并且其表達(dá)程度與膠質(zhì)瘤惡性程度成正比。 膠質(zhì)瘤組織RT-PCR結(jié)果顯示，Basigin/CD147mRNA的表達(dá)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中陽性率為83.3％，明顯高于正常腦組織中的陽性率25％（P<0.05）。在陽性表達(dá)病理中，對(duì)Basigin/CD147mRNA的RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行半定量測(cè)定（

8、Basigin/β-actin），結(jié)果顯示Basigin/CD147mRNA在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)量為0.274±0.087，明顯高于正常組織0.081±0.043，兩者具有顯著性差異（P<0.05）。此結(jié)果提示Basigin/CD147的表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生有關(guān)。 第二部分：Basigin/CD147 反義RNA表達(dá)載體的建立及重組人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251/147的克隆建立及篩選。 構(gòu)建了Basigin/CD1

9、47反義RNA質(zhì)粒,用反義RNA特異封閉腫瘤細(xì)胞的Mrna, 封閉膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面Basigin/CD147的表達(dá), 從而抑制其刺激腫瘤細(xì)胞分泌MMPs，進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲。我們選擇表達(dá)Basigin/CD147的U251細(xì)胞系作為反義核酸的封閉靶點(diǎn)，進(jìn)而研究其被抑制后的生物學(xué)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)PCI-147重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251后，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果證實(shí)細(xì)胞膜表面熒光強(qiáng)度減弱。Western Blot檢測(cè)

10、結(jié)果也證實(shí)Basigin/CD147表達(dá)降低。這些變化主要是由于反義RNA與CD147mRNA結(jié)合，阻礙了其翻譯過程，封閉了Basigin/CD147分子的表達(dá)。 第三部分：Basigin/CD147反義核酸對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。 明膠酶譜實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，U251/147細(xì)胞分泌的MMP-2和MMP-9顯著低于U251細(xì)胞和U251/neo細(xì)胞。說明CD147反義核酸的確影響了U251細(xì)胞明膠酶的分泌

11、。U251/147細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF水平顯著低于U251細(xì)胞和U251/neo細(xì)胞，分別降低了37.61％和42.76％，說明CD147有促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞VEGF分泌的作用，而CD147反義核酸抑制了U251細(xì)胞VEGF的分泌。重組基底膜實(shí)驗(yàn)中可以看出，U251/147細(xì)胞侵襲人工重組基底膜的數(shù)目顯著少于U251細(xì)胞和U251/neo細(xì)胞，U251/147細(xì)胞的穿膜數(shù)較U251細(xì)胞和U251/neo細(xì)胞分別降低了65.8％和70.1％