Basigin-CD147在人神經(jīng)膠質瘤侵襲中的作用機制及其反義RNA抑制神經(jīng)膠質瘤侵襲的實驗研究.pdf

1、膠質瘤是顱內常見惡性腫瘤，占顱內腫瘤的35.26％～60.96％，平均44.69％，目前尚無根治方法。膠質瘤具有發(fā)病率、復發(fā)率、死亡率高和治愈率低等“三高一低”的特點。惡性膠質瘤預后極差，中位生存時間少于18個月，2年存活率約為5％。膠質瘤多呈浸潤性生長，手術難以全切，需結合放療、化療、生物治療等綜合治療手段以延長病人生存期。隨著影像學技術的發(fā)展，膠質瘤的診斷、治療取得了一定進展，但總體療效并未實現(xiàn)突破。因此，神經(jīng)膠質瘤是神經(jīng)外科的難題

2、和醫(yī)學研究的重要課題之一。 造成神經(jīng)膠質瘤死亡率高的主要原因是神經(jīng)膠質瘤的高侵襲性。其侵襲過程中的一個重要因素是細胞外基質的降解，其中，起重要作用的是一類Zn2+依賴的基質金屬蛋白酶MMPs（Matrix metalloproteinases）。MMPs能夠破壞局部組織結構和基底膜屏障，促進腫瘤生長和轉移，并且可促進腫瘤新生血管的形成。CD147作為MMPs的誘導因子，是一個廣泛表達的質膜糖蛋白，參與機體多種生理和病理過程。CD

3、147分子表達于許多正常細胞類型，包括成體和胚胎組織。它在炎癥的發(fā)生發(fā)展、病毒的易化介導、細胞之間的黏附及胚胎發(fā)育等方面起著一定的作用。研究證實，CD147表達于各種腫瘤組織特別是惡性腫瘤，如乳腺癌、肺癌、腎癌、惡性黑色素瘤、淋巴瘤等，同時其表達較相應正常組織明顯要高。 近年來一些研究發(fā)現(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，CD147表達于血腦屏障內皮細胞、脈絡膜上皮細胞和視網(wǎng)膜色素上皮細胞，并在血腦屏障中起作用。但缺乏CD147分子在神經(jīng)系統(tǒng)及

4、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中表達的系統(tǒng)性研究。以往研究雖然表明CD147功能上與某些惡性腫瘤，如肝癌存在相關性，提示其在致病機制上是一個非常重要的因子，但更明確的作用機制還需要進一步深入探討。另外，CD147在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，尤其是神經(jīng)膠質瘤侵襲中的作用如何還不明確。 本研究收集了18例神經(jīng)膠質瘤樣本，并采用63點膠質瘤組織芯片檢測Basigin/CD147在人腦組織及神經(jīng)膠質瘤組織中的表達情況。分別在組織水平及基因水平分析了Basigin/C

5、D147的表達與臨床病理學特征的關系；構建Basigin/CD147反義RNA表達載體，建立并篩選低表達CD147的重組人神經(jīng)膠質瘤細胞株U251/147的克??；并進一步采用反義RNA技術研究Basigin/CD147在膠質瘤侵襲、血管形成方面的作用及機制。 第一部分：Basigin/CD147 在人神經(jīng)膠質瘤組織中的表達及臨床意義。 收集了18例神經(jīng)膠質瘤樣本，并采用63點膠質瘤組織芯片檢測CD147的表達情況。結果

6、發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)膠質瘤組織中Basigin/CD147表達于腫瘤細胞膜和細胞質中，但未見細胞核染色。神經(jīng)膠質瘤組織中Basigin/CD147蛋白的陽性表達率為74.3％。而正常腦組織中僅血管內皮細胞漿有陽性著色，神經(jīng)細胞及神經(jīng)膠質細胞未見表達。表明在正常腦組織中CD147僅表達于血管內皮。此研究結果說明與正常腦組織相比，神經(jīng)膠質瘤組織中Basigin/CD147存在過度表達。不同級別膠質瘤細胞著色結果分析發(fā)現(xiàn)，在膠質瘤細胞胞漿中有CD147

7、著色，并且高級別星型膠質瘤（III、IV級）瘤細胞胞漿CD147著色顯著強于低級別星型膠質瘤（I、II級）。說明膠質瘤細胞不僅表達CD147，并且其表達程度與膠質瘤惡性程度成正比。 膠質瘤組織RT-PCR結果顯示，Basigin/CD147mRNA的表達在神經(jīng)膠質瘤組織中陽性率為83.3％，明顯高于正常腦組織中的陽性率25％（P<0.05）。在陽性表達病理中，對Basigin/CD147mRNA的RT-PCR產(chǎn)物進行半定量測定（

8、Basigin/β-actin），結果顯示Basigin/CD147mRNA在神經(jīng)膠質瘤組織中的表達量為0.274±0.087，明顯高于正常組織0.081±0.043，兩者具有顯著性差異（P<0.05）。此結果提示Basigin/CD147的表達與神經(jīng)膠質瘤的發(fā)生有關。 第二部分：Basigin/CD147 反義RNA表達載體的建立及重組人神經(jīng)膠質瘤細胞株U251/147的克隆建立及篩選。 構建了Basigin/CD1

9、47反義RNA質粒,用反義RNA特異封閉腫瘤細胞的Mrna, 封閉膠質瘤細胞表面Basigin/CD147的表達, 從而抑制其刺激腫瘤細胞分泌MMPs，進而抑制膠質瘤細胞的侵襲。我們選擇表達Basigin/CD147的U251細胞系作為反義核酸的封閉靶點，進而研究其被抑制后的生物學變化。實驗結果表明，當PCI-147重組質粒轉染人神經(jīng)膠質瘤細胞U251后，轉染細胞的流式細胞檢測結果證實細胞膜表面熒光強度減弱。Western Blot檢測

10、結果也證實Basigin/CD147表達降低。這些變化主要是由于反義RNA與CD147mRNA結合，阻礙了其翻譯過程，封閉了Basigin/CD147分子的表達。 第三部分：Basigin/CD147反義核酸對人神經(jīng)膠質瘤細胞U251侵襲轉移能力的影響。 明膠酶譜實驗發(fā)現(xiàn)，U251/147細胞分泌的MMP-2和MMP-9顯著低于U251細胞和U251/neo細胞。說明CD147反義核酸的確影響了U251細胞明膠酶的分泌

11、。U251/147細胞培養(yǎng)上清中VEGF水平顯著低于U251細胞和U251/neo細胞，分別降低了37.61％和42.76％，說明CD147有促進膠質瘤細胞VEGF分泌的作用，而CD147反義核酸抑制了U251細胞VEGF的分泌。重組基底膜實驗中可以看出，U251/147細胞侵襲人工重組基底膜的數(shù)目顯著少于U251細胞和U251/neo細胞，U251/147細胞的穿膜數(shù)較U251細胞和U251/neo細胞分別降低了65.8％和70.1％