鈣池操縱的鈣內(nèi)流在膠質(zhì)瘤侵襲遷移中的作用.pdf

1、研究目的：
　　膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)最常見的腫瘤，其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)惡性度最高，預(yù)后最差。膠質(zhì)瘤浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的生物學(xué)特性使得手術(shù)不可能完全切除全部的腫瘤細(xì)胞，殘存的腫瘤細(xì)胞對(duì)輔助放化療的抵抗并繼續(xù)在腦組織內(nèi)侵襲遷移是膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)及在CNS內(nèi)播散的主要根源。鈣離子作為細(xì)胞內(nèi)第二信使，介導(dǎo)多種信號(hào)通路，參與調(diào)控細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。最近研究

2、發(fā)現(xiàn)，鈣信號(hào)與惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。鈣池操縱的鈣內(nèi)流(store-operatedCa2+entry,SOCE)由基質(zhì)相互作用分子1(stromal interaction molecule1,STIM1)與鈣釋放激活的鈣通道蛋白1(Ca2+release-activated calcium channel protein1,Orai1)介導(dǎo)，是非興奮細(xì)胞內(nèi)鈣的來源途徑之一。本研究擬探討SOCE及其相關(guān)蛋白在膠質(zhì)瘤侵襲遷移中的作用及

3、機(jī)制，為膠質(zhì)瘤的抗侵襲遷移治療尋找新的靶點(diǎn)。
　　研究方法：
　　利用免疫組化、western blot檢測(cè)人腦膠質(zhì)瘤手術(shù)標(biāo)本及膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中STIM1與Orai1的表達(dá)特征。為研究SOCE在膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲遷移過程中的作用，采用兩種方式阻斷SOCE：應(yīng)用藥理學(xué)抑制劑 SKF96365干預(yù)或者RNA干擾敲低膠質(zhì)瘤細(xì)胞中SOCE組成蛋白Orai1的表達(dá)；另外，為行恢復(fù)實(shí)驗(yàn)，在Orai1沉默的腫瘤細(xì)胞中重新表達(dá)目的蛋白。應(yīng)用wes

4、tern blot、qRT-PCR驗(yàn)證Orai1敲低或重新表達(dá)的情況；應(yīng)用Fluo-4/AM鈣熒光指示劑法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中SOCE的幅度變化；通過劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀察SOCE對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲遷移能力的影響。通過黏著斑蛋白vinculin免疫熒光染色觀察不同組別腫瘤細(xì)胞中黏著斑的位置、數(shù)目及大?。粦?yīng)用western blot檢測(cè)E-cadherin、N-cadherin、vimentin的表達(dá)，觀察SOCE對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中

5、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)樣改變的影響；應(yīng)用western blot檢測(cè)鈣依賴性富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(proline-rich tyrosine kinase2，Pyk2)的總量及磷酸化的量，分析其活化程度。通過RNA干擾敲低Pyk2的表達(dá)，進(jìn)一步研究SOCE是否是通過下游Pyk2信號(hào)通路發(fā)揮作用。應(yīng)用SKF96365或者RNA干擾敲低C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Orai1的

6、表達(dá)，研究SOCE對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞體內(nèi)外侵襲遷移能力的影響。
　　研究結(jié)果：
　　SOCE相關(guān)蛋白STIM1在非腫瘤性對(duì)照腦組織及各級(jí)別膠質(zhì)瘤中均呈現(xiàn)低表達(dá)；而Orai1在對(duì)照腦組織中呈現(xiàn)低表達(dá)，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和膠質(zhì)瘤標(biāo)本中表達(dá)上調(diào)，且與腫瘤病理級(jí)別呈正相關(guān)。針對(duì)Orai1的RNA干擾能夠不同程度抑制U251、SNB19膠質(zhì)瘤細(xì)胞中SOCE的幅度。SKF96365及Orai1沉默能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移及侵襲能力。與對(duì)照組相

7、比，SKF96365處理組及Orai1沉默組細(xì)胞外周區(qū)域黏著斑的面積增大；同時(shí)，E-cadherin的表達(dá)升高，而N-cadherin、vimentin的表達(dá)降低。Pyk2活性分析提示SOCE受到抑制后，Pyk2總量不變而磷酸化Pyk2的表達(dá)降低。然而，Orai1重新表達(dá)均能夠逆轉(zhuǎn)Orai1沉默所引起的上述變化。Pyk2沉默能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力。Pyk2沉默組細(xì)胞外周區(qū)域黏著斑的面積增大；同時(shí)，E-cadherin的表達(dá)升高，而

8、N-cadherin、vimentin的表達(dá)降低。SKF96365及Orai1沉默能夠抑制C6細(xì)胞在體外的侵襲遷移能力。Orai1沉默能夠抑制 C6細(xì)胞在大鼠顱內(nèi)的侵襲遷移，并抑制腫瘤細(xì)胞向血管旁聚集形成腫瘤小生境。
　　結(jié)論：
　　SOCE通過調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Pyk2的活性，繼而調(diào)節(jié)細(xì)胞黏著斑周轉(zhuǎn)的速度及EMT樣改變，參與膠質(zhì)瘤的侵襲遷移惡性生物學(xué)行為。下調(diào)SOCE能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞在體內(nèi)外的侵襲遷移，Orai1可能會(huì)成為