CD147、MMP-2在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及CD147單抗抑制U251細(xì)胞侵襲性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)在惡性腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，而CD147作為．MMPs的誘導(dǎo)因子，可促進(jìn)腫瘤及間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)MMPs。本研究旨在：(1)探討CD147和MMP-2在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)與腫瘤的級(jí)別、侵襲及預(yù)后的關(guān)系；(2)在體外試驗(yàn)中運(yùn)用CD147基因工程單抗影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面CD147的表達(dá)，探討其對(duì)腫瘤侵襲性的抑制作用及其作用機(jī)理。 方法： 1．

2、標(biāo)本來(lái)源：收集四川大學(xué)華西醫(yī)院2001年至2004年間50例腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本，男性28例，女性22例，年齡22～67歲，平均年齡48．2歲，根據(jù)WHO分類，膠質(zhì)瘤Ⅰ　級(jí)5例，Ⅱ級(jí)18例，Ⅲ級(jí)9例，Ⅳ級(jí)18例，對(duì)照組10例為內(nèi)減壓術(shù)中切除的正常腦組織。體外實(shí)驗(yàn)采用人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U251和鼠成纖維細(xì)胞株NIH3T3進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。 2．主要試劑： CD147、MMP-2、MT1-MMP、MT2-MMP均為鼠抗人單克隆抗體、S-P免

3、疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、CD147基因工程單克隆抗體。 3．方法：將膠質(zhì)瘤和對(duì)照腦組織新鮮冰凍標(biāo)本做RT-PCR對(duì)各級(jí)別CD147的mRNA進(jìn)行半定量分析；并石蠟切片進(jìn)行免疫組化染色，檢測(cè)各級(jí)別膠質(zhì)瘤和對(duì)照標(biāo)本CD147和MMP-2的表達(dá)水平，結(jié)合隨訪資料進(jìn)行預(yù)后分析。細(xì)胞培養(yǎng)分組：第一組成纖維細(xì)胞NIH3T3；第二組CDl47陽(yáng)性表達(dá)人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U251；第三組不同濃度U251+NIH3T3細(xì)胞。第四組：在不同

4、濃度U251+NIH3T3細(xì)胞共同培養(yǎng)組中分別加入不同劑量的CD147基因工程單抗共同孵育以封閉細(xì)胞表面CD147分子表達(dá)，用明膠酶譜實(shí)驗(yàn)(Zymography)檢測(cè)分析各組細(xì)胞及共同孵育組酶原型MMP-2及激活型MMP-2蛋白表達(dá)量，Western-blot檢測(cè)各組細(xì)胞及共同孵育組CD1-47、MMP-2、MT1-MMP和MT2-MMP蛋白表達(dá)量，根據(jù)信號(hào)強(qiáng)弱分析蛋白表達(dá)量。以上資料均作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 4．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：各組間計(jì)量

5、資料的比較采用方差分析，兩組間計(jì)數(shù)資料比較采用x<'2>檢驗(yàn)，非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，Spearman等級(jí)相關(guān)性分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為a=0.05(雙側(cè))，所有數(shù)據(jù)分析均在SPSS12.0軟件中完成。 結(jié)果： 1．免疫組化檢測(cè)各級(jí)別膠質(zhì)瘤標(biāo)本中均有CD147和MMP-2的表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)到各級(jí)別膠質(zhì)瘤標(biāo)本中CD147 mRNA的表達(dá)，隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別增高，CD147和MMP-2表達(dá)陽(yáng)性率增高，CD147 mRNA表達(dá)水平也增高，對(duì)

6、照組為弱表達(dá)或無(wú)表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2．在細(xì)胞培養(yǎng)研究中，Zymography檢測(cè)顯示，在藍(lán)色背景呈兩條不同分子量的白色酶裂解明膠條帶：酶原型MMP-2(68-kDa)和激活型MMP-2(62-kDa)，含有NIH3T3細(xì)胞的培養(yǎng)組均有兩種條帶顯示，隨細(xì)胞種類及濃度不同兩種酶含量亦不相同，U251+NIH3T3細(xì)胞共同培養(yǎng)組中兩種酶含量最高，隨著U251細(xì)胞濃度的增高，激活型高于酶原型，單獨(dú)U251細(xì)胞培養(yǎng)組兩種酶含量呈弱

7、表達(dá)或無(wú)表達(dá)。同時(shí)Western-blot檢測(cè)顯示，U251組CD147蛋白表達(dá)明顯，酶原型MMP-2呈弱表達(dá)或無(wú)表達(dá)，NIH3T3組無(wú)CD147蛋白表達(dá)，酶原型MMP-2有表達(dá)，兩種細(xì)胞共同培養(yǎng)組中酶原型MMP-2較強(qiáng)，兩種細(xì)胞與CD147基因工程單抗共同孵育組酶原型MMP-2蛋白表達(dá)減弱，隨著CD147基因工程單抗劑量增加酶原型MMP-2蛋白表達(dá)逐漸減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示CD147基因工程單抗對(duì)酶原型MMP-2蛋白表達(dá)量呈劑量

8、依賴性抑制作用。Western-blot檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組MT1-MMP和MT2-MMP蛋白的表達(dá)結(jié)果與酶原型MMP-2相似，且CD147基因工程單抗對(duì)MT1-MMP和MT2-MMP蛋白表達(dá)量也呈劑量依賴性抑制作用。 結(jié)論：CD147和MMP-2在人腦膠質(zhì)瘤侵襲性生長(zhǎng)過(guò)程中起重要作用，在人腦膠質(zhì)瘤中CD147和MMP-2呈高表達(dá)，且隨級(jí)別增高而增強(qiáng)，在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中表達(dá)最強(qiáng)。在體外實(shí)驗(yàn)中，己1251+NIH3T3細(xì)胞共同培養(yǎng)組中U25

9、1細(xì)胞表達(dá)的CD147刺激成纖維細(xì)胞產(chǎn)生MMP-2和膜型MMPs(MT1-MMP和MT2-MMP)，MT1-MMP和MT2-MMP作為MMP-12的激活因子可激活酶原型MMP-2；CD147基因工程單抗可以抑制U251細(xì)胞CD147的表達(dá)和生物學(xué)活性，從而抑制MMP-2、MT1-MMP和MT2-MMP的分泌，使腫瘤侵襲生長(zhǎng)受到抑制。CD147和MMP-2表達(dá)水平可作為膠質(zhì)瘤患者判斷臨床預(yù)后和制定診療計(jì)劃有意義的參考指標(biāo)，為腦膠質(zhì)瘤靶向治