谷氨酸受體對膠質(zhì)瘤U251細胞分泌侵襲因子MMP-2的調(diào)控作用.pdf

1、膠質(zhì)瘤是原發(fā)性腦腫瘤中最常見的腫瘤類型之一，占所有原發(fā)性腦腫瘤的70％以上，其中惡性程度最高的是膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）?，F(xiàn)在的膠質(zhì)瘤治療模式包括：外科手術(shù)切除，放射治療和化學(xué)治療。由于膠質(zhì)瘤呈侵襲性生長，腫瘤組織與正常腦組織界限不清，導(dǎo)致全切除困難；加上血腦屏障的存在，使得抗腫瘤藥物作用有限。因此，GBM患者診斷后5年生存率不足3%，膠質(zhì)母細胞瘤的中位生存期約1年。所以很好的認(rèn)知膠質(zhì)瘤生長和侵襲的特性對于提高膠質(zhì)瘤患者治療效果是有必要的

2、。
　　細胞外基質(zhì)(extracelluar matrix,ECM)的降解對膠質(zhì)瘤細胞的侵襲行為是極為重要的，此行為通過ECM與整合素結(jié)合來介導(dǎo)。在原發(fā)性腦腫瘤中，ECM是過度表達的，它為腫瘤細胞的侵襲提供充足的基質(zhì)。MMP-2和MMP-9是細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶家族中研究最為廣泛的2種酶。它們屬于VI型膠原酶，也稱為明膠酶A和B。MMP-2和MMP-9的主要功能是降解細胞外基質(zhì)中的各種蛋白成分，破壞腫瘤細胞侵襲的組織學(xué)屏障，對腫瘤

3、的增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)揮主要的作用。Susan A等研究發(fā)現(xiàn)，惡性膠質(zhì)瘤通過Xc系統(tǒng)釋放谷氨酸，它能殺死瘤周的腦細胞，為腫瘤的擴張創(chuàng)造空間。而自分泌或旁分泌的谷氨酸也能促進腫瘤細胞的侵襲。
　　谷氨酸受體包括離子型受體和促代謝型受體，離子型受體包括：NMDAR和AMPAR等，促代謝型受體分為三組：Ⅰ組包括 mGLUR1、mGLUR5；Ⅱ組包括 mGLUR2-3；Ⅲ組包括 mGLUR4、mGLUR6-8。Ⅰ組代謝型受體在活化形式下

4、能激活PLC，產(chǎn)生IP3，使鈣離子從細胞內(nèi)鈣庫釋放，經(jīng)過一系列復(fù)雜的反應(yīng)，提高神經(jīng)細胞的興奮性和促進其的敏感性。
　　我們先前實驗結(jié)果表明，體外培養(yǎng)的U251細胞株加入離子型受體NMDAR非競爭性拮抗劑MK-801可以通過降低MMP-2的活性來抑制膠質(zhì)瘤U251細胞的侵襲，但具體作用機制尚不清楚。
　　由于谷氨酸受體種類較多，膠質(zhì)瘤細胞自分泌或旁分泌的谷氨酸促進細胞侵襲是通過何種谷氨酸受體來介導(dǎo)的，以及對腫瘤細胞分泌MMP-

5、2或MMP-9有何影響，目前尚未見報道。本課題將研究谷氨酸受體對膠質(zhì)瘤U251細胞分泌MMP-2活性水平和蛋白量的影響及可能的機制。初步探討谷氨酸受體在膠質(zhì)瘤U251細胞侵襲中的作用。
　　研究目的：
　　研究谷氨酸受體（AMPAR，NMDAR，mGluR1和mGluR5）在體外對膠質(zhì)瘤U251細胞分泌MMP-2活性水平和MMP-2蛋白量的影響，初步探討谷氨酸受體在膠質(zhì)瘤U251細胞侵襲中的作用。
　　實驗方法：

6、>　　1.體外培養(yǎng)人腦膠質(zhì)瘤細胞系 U251，用含不同濃度的離子型谷氨酸受體拮抗劑NBQX(10μM、20μM、40μM)和Memantine(10μM、20μM、40μM)作用24h后及使用同一濃度的離子型谷氨酸受體拮抗劑20μM NBQX和20μM Memantine的高糖DMEM分別處理U251細胞4h、8h、16h、24h后收集培養(yǎng)基的上清液，明膠酶譜法檢測在不同條件下上清中U251細胞分泌MMP-2活性水平的變化。
　　

7、2.使用不同濃度的代謝型谷氨酸受體-1拮抗劑Ly367385(5μM、10μM、15μM)和代謝型谷氨酸受體-5拮抗劑MPEP(20μM、50μM、75μM、100μM、150μM)作用24小時后以及使用10μM Ly367385和100μM MPEP作用4h、8h、16h、24h后收集上清，明膠酶譜法檢測在不同條件下上清中U251細胞分泌MMP-2活性水平的變化。
　　3.用各谷氨酸受體拮抗劑(NBQX20μM，Memantin

8、e20μM，Ly36738510μM，MPEP100μM)作用U251細胞24h后收集細胞蛋白，用蛋白印跡法(Western blotting)分別檢測各組U251細胞作用24h后表達MMP-2蛋白量的差異。
　　研究結(jié)果：
　　明膠酶譜法檢測結(jié)果顯示：
　　1、各濃度的NBQX作用于U251細胞24h后 MMP-2的活性水平均明顯低于對照組，并且隨著NBQX濃度的增加，MMP-2活性水平逐漸下降，p<0.05。20μ

9、M NBQX作用8h、12h、24h U251細胞分泌MMP-2的活性水平明顯低于對照組，并且在24h時下降更明顯，p<0.05。
　　2、20μM、40μM Memantine作用于U251細胞24h后MMP-2的活性水平均明顯低于對照組，并且隨著濃度是增加MMP-2活性水平下降更明顯，p<0.05。20μM Memantine作用8h、12h、24h后U251細胞分泌MMP-2的活性水平明顯低于對照組，并且在24h時下降更明顯

10、，p<0.05。
　　3、各濃度的Ly367385作用于U251細胞24h后MMP-2的活性水平均明顯低于對照組，并且隨著濃度增加 MMP-2活性水平下降更明顯，p<0.05。10μM Ly367385作用8h、12h、24h U251細胞表達MMP-2活性水平明顯低于對照組，并且在24h時下降更明顯，p<0.05。
　　4、各濃度MPEP作用于U251細胞24h后MMP-2的活性水平均明顯低于對照組，并且隨著濃度增加MMP

11、-2活性水平下降更明顯，p<0.05。100μM MPEP作用12h、24h U251細胞分泌MMP-2的活性水平明顯低于對照組，并且在24h時下降更明顯，p<0.05。
　　免疫印跡法實驗結(jié)果：
　　對照組與各用藥組相比對U251細胞表達 pro-MMP-2蛋白的量無顯著差異(p>0.05)；對照組與Memantine，Ly367385組相比對U251細胞表達MMP-2蛋白的量無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)，NBQX(20μ

12、M)和MPEP(100μM)組與對照組相比對U251細胞表達MMP-2蛋白量的差異顯著(p<0.01)。
　　結(jié)論：
　　1.NBQX、Memantine、Ly367385和MPEP特異性阻斷谷氨酸受體 AMPAR、NMDAR、mGluR1與mGluR5能下調(diào)膠質(zhì)瘤U251細胞分泌MMP-2的活性水平。且MMP-2活性呈時間和劑量依賴性的下降。
　　2. NBQX和MPEP能顯著降低膠質(zhì)瘤 U251細胞分泌 MMP-2