PCBP2在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中的作用及其分子機制.pdf

1、Poly(C)結(jié)合蛋白(PCBPs)是RNA結(jié)合蛋白，結(jié)合單鏈Poly(C)特異序列上的靶位點。該家族被分為兩大類：即hnRNPK和PCBP1-4。這些蛋白主要參與轉(zhuǎn)錄后水平的各種調(diào)控（比如mRNA穩(wěn)定性或翻譯增強/沉默）。PCBPs包含三個KH結(jié)構(gòu)域，兩個連續(xù)的KH結(jié)構(gòu)域在氨基端，第三個KH結(jié)構(gòu)域在羧基端，被一個長度可變的中間序列分開。PCBPs通過它們的KH結(jié)構(gòu)域識別和結(jié)合poly(C)RNA序列的能力對于它們在哺乳動物細胞中的功能

2、是非常重要的。已有研究報道該家族成員hnRNPK，PCBP1和PCBP2通過結(jié)合靶mRNA在各種人類腫瘤細胞中發(fā)揮重要作用。目前還沒有任何文獻報道該家族成員在人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中的表達和作用。本論文對PCBP2在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達，作用及其下游分子機制進行了初步研究。
　　 我們利用Real-timePCR，WesternBlot和免疫組織化學(xué)的方法檢測了在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系和原發(fā)性腫瘤組織中PCBP2的表達變化，結(jié)果顯示PCB

3、P2在膠質(zhì)瘤細胞系和原發(fā)性腫瘤組織中表達上調(diào)。為進一步研究PCBP2可能的功能，我們合成了PCBP2siRNA，轉(zhuǎn)染PCBP2siRNA到T98G、U87MG和U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系中可以有效地干擾PCBP2的表達。此后，我們利用MTT和細胞計數(shù)發(fā)現(xiàn)敲低PCBP2可以抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖能力；我們還構(gòu)建了PCBP2干擾重組腺病毒，用腺病毒進行裸鼠成瘤實驗發(fā)現(xiàn)敲低PCBP2還能在體內(nèi)抑制膠質(zhì)瘤細胞的成瘤能力；利用BrdU摻入和流式細胞

4、術(shù)的方法發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中敲低PCBP2后可以抑制細胞周期的進程并造成DNA合成的阻滯；利用Hoechst染色，TUNEL法和檢測Caspase-3及其底物PARP的剪切產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)敲低PCBP2可以誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞發(fā)生Caspase-3通路介導(dǎo)的細胞凋亡。因此，我們初步推論PCBP2可能作為一個治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的分子靶點。同時我們還發(fā)現(xiàn)，PCBP2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中可能參與TGF-β1/Smads通路和P53通路的調(diào)控，具體分子機制還

5、有待我們進一步研究。
　　 在上述工作基礎(chǔ)上，我們對PCBP2調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤增殖、凋亡的分子機制進行了初步探討。我們用RIP-Chip技術(shù)在膠質(zhì)瘤細胞中篩選PCBP2的靶mRNA，通過三次重復(fù)實驗一共得到35條候選靶mRNA。結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測，我們最后發(fā)現(xiàn)這35條mRNA中有9條含有PCBP2結(jié)合位點，其編碼基因可能參與細胞周期或凋亡調(diào)控，并用Real-timePCR對芯片結(jié)果進行了初步驗證。隨后，我們用biotinpull-

6、down對這條候選靶mRNA結(jié)合PCBP2的部位進行了確認(rèn)，最終確定7條mRNA中的8個片段可以結(jié)合PCBP2。我們同時還發(fā)現(xiàn)FHL3mRNA的3’UTR的A段可以和PCBP2高度特異結(jié)合，并且進一步找到了它的核心識別序列。
　　 FHL3作為一個我們新發(fā)現(xiàn)的PCBP2靶基因，是FHL(fourandahalfLIM)家族的重要成員。FHL家族包括FHL1～FHL5共5個成員。它們的表達具有組織特異性。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL參與轉(zhuǎn)錄調(diào)

7、節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡等，是細胞生長、分化的重要調(diào)節(jié)因子。我們用WesternBlot和免疫組化技術(shù)檢測FHL3在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和細胞中表達水平低于正常，敲低PCBP2可以增強FHL3蛋白表達水平，提示PCBP2可能反式調(diào)控FHL3表達。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灪蚼RNA半衰期分析證實在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中PCBP2可以通過影響FHL3mRNA穩(wěn)定性，進而調(diào)節(jié)其蛋白水平。為了了解FHL3在膠質(zhì)瘤細胞中的作用，我們在T98G膠質(zhì)瘤細胞中過表達FHL

8、3，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細胞的增殖能力減弱，發(fā)生凋亡的細胞數(shù)目增加。同時敲低PCBP2和FHL3可以恢復(fù)腫瘤細胞的大部分的增殖能力，減少細胞的凋亡，說明敲低PCBP2可以通過上調(diào)FHL3抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖和誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡。
　　 為了進一步研究FHL3在膠質(zhì)瘤細胞中的分子機制，我們用biotinpull-down結(jié)合質(zhì)譜鑒定技術(shù)發(fā)現(xiàn)了包括PCBP2在內(nèi)的22個蛋白都可以直接或間接地結(jié)合FHL3mRNA3’UTR。除此之外我們還發(fā)現(xiàn)，

9、FHL3同家族成員FHL2，其蛋白水平可能受FHL3的負調(diào)控，但其mRNA水平不受影響。我們選擇DNA基因芯片技術(shù)篩選在FHL3過表達的情況下T98G細胞內(nèi)基因表達譜的變化。一共篩選到708個表達差異基因，其中420個表達下調(diào)，288個表達上調(diào)。根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測和相關(guān)文獻報道，我們發(fā)現(xiàn)其中28個基因參與膠質(zhì)瘤細胞的增殖，凋亡或侵襲。我們將Real-timePCR和芯片結(jié)果進行對比，最終在這28個基因中篩選出11個基因進行下一步驗證。關(guān)