新的抑癌基因PDCD4在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的缺失及其機(jī)制研究.pdf

1、目的： 腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，占顱內(nèi)腫瘤的35.12％～61.10％。目前臨床治療膠質(zhì)瘤的方法主要是手術(shù)治療、放療、化療，近幾十年來，盡管新的診療技術(shù)不斷出現(xiàn)，但由于大多數(shù)膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長，與周圍腦組織邊界不清，治療效果不佳，病人的總體生存率沒有明顯改進(jìn)。分子生物學(xué)研究的不斷深入，為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤的基因治療提供了廣闊前景，近些年來，人們越來越多地把目光投向膠質(zhì)瘤的基因治療。因此，尋找可用于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤治療的靶基因?qū)?/p>

2、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤的治療有重要價值。 為了明確PDCD4與人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，進(jìn)一步以PDCD4為靶點進(jìn)行基因治療提供實驗依據(jù)，本論文從以下三個方面進(jìn)行了研究： 1.PDCD4在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)狀態(tài)及其臨床意義 2.PDCD4 5’CpG島甲基化與膠質(zhì)瘤PDCD4mRNA缺失的關(guān)系 3.外源性PDCD4在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的表達(dá)及其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長、凋亡和克隆形成的影響。 方法：

3、 一、PDCD4在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)狀態(tài)及其臨床意義 1.病例的收集：收集山東大學(xué)齊魯醫(yī)院神經(jīng)外科2003-2006年神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的新鮮手術(shù)標(biāo)本總共30例包括其中3例相應(yīng)患者的癌旁組織，以及石蠟包埋的腫瘤標(biāo)本61例。所有患者術(shù)前未接受任何放、化療治療。 2.分別用RT-PCR、Western blot和免疫組化方法檢測神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251、U87以及腫瘤組織中PDCD4 mRNA和蛋白的表達(dá)情況。 3.

4、x2檢驗分析PDCD4在不同膠質(zhì)瘤病例中的表達(dá)與膠質(zhì)瘤臨床病理特點間的關(guān)系。Kaplan-Meier生存曲線以及Cox多因素回歸分析PDCD4在不同膠質(zhì)瘤病例中的表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者生存率之間的關(guān)系。 二、PDCD4 5’CpG島高頻甲基化與膠質(zhì)瘤PDCD4mRNA缺失的關(guān)系 1.PDCD4 5’CpG島甲基化的檢測：從腫瘤組織以及膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中提取基因組DNA，用重亞硫酸鹽修飾基因組DNA，用甲基化特異性PCR(MSP)的

5、方法檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞系以及腫瘤標(biāo)本中PDCD4甲基化的情況。 2.去甲基化處理后對PDCD4表達(dá)的影響：通過去甲基化藥物5-氮雜-2-脫氧胞苷(5-Aza-CdR)處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，利用甲基化特異性PCR(MSP)的方法檢測PDCD4的甲基化情況；利用RT-PCR、Western blot以及細(xì)胞免疫化學(xué)觀察PDCD4的恢復(fù)表達(dá)情況。 3.采用Pearson's相關(guān)系數(shù)分析PDCD45’CpG島甲基化與膠質(zhì)瘤PDCD4mR

6、NA缺失的關(guān)系。 三、外源性PDCD4在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的表達(dá)及其對細(xì)胞生長、凋亡和克隆形成的影響 1.用空載體或PDCD4重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，利用RT-PCR和Westernblot方法檢測PDCD4在轉(zhuǎn)染后入神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)，分別建立PDCD4表達(dá)與缺失的腫瘤細(xì)胞模型。 2.倒置顯微鏡觀察PDCD4在轉(zhuǎn)染前后人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系生長、分化的形態(tài)學(xué)變化。 3.流式細(xì)胞術(shù)分析PDCD4轉(zhuǎn)染

7、后人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系凋亡與細(xì)胞周期的變化情況。 4.克隆形成實驗觀察PDCD4轉(zhuǎn)染后人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系集落形成程度的變化情況結(jié)果一、PDCD4在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)狀態(tài)及其臨床意義 結(jié)論： 1.PDCD4在人原發(fā)性膠質(zhì)瘤中存在高頻缺失；在高級別(Ⅲ-Ⅳ級)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者中，PDCD4表達(dá)的缺失與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后具有明顯相關(guān)性，而且是膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨立預(yù)測因素。 2.PDCD4 5’CpG島的甲

8、基化是膠質(zhì)瘤PDCD4mRNA表達(dá)缺失的直接原因。 3.PDCD4在膠質(zhì)瘤細(xì)胞再表達(dá)可明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長和克隆形成能力，其機(jī)制可能是通過干擾細(xì)胞的生長周期以及誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。 創(chuàng)新性和意義 1.本研究的創(chuàng)新點是在國內(nèi)外首先發(fā)現(xiàn)PDCD4在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)出現(xiàn)高頻率缺失，而且與病人的預(yù)后有關(guān)。并在體外實驗發(fā)現(xiàn)PDCD4可通過干擾細(xì)胞生長周期以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的克隆形

9、成能力。為以PDCD4為靶點進(jìn)行基因治療提供了第一手資料。 2.證明CpG島甲基化是PDCD4mRNA在腫瘤細(xì)胞表達(dá)缺失的原因之一。盡管我們和其他學(xué)者報道PDCD4在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肺癌和胰腺癌中表達(dá)缺失，但對其缺失的原因，尚未見報道。我們從表觀遺傳學(xué)的角度，提供證據(jù)證明CpG島甲基化是PDCD4mRNA在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞表達(dá)缺失的主要原因，為探索通過恢復(fù)PDCD4表達(dá)治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤奠定了基礎(chǔ)。 研究的局限性 1.PD